血吸虫病(Schistosomiasis)是由血吸虫(Schistosome)感染引起的一种危害严重的人畜共患寄生虫病。尽管近年来采用了大量抗血吸虫药物治疗和其他一些防控措施,但由于中间宿主钉螺难于消灭以及药物不能防止再感染等原因,血吸虫病仍是我国一个重要的公共卫生问题。研究开发有明确保护作用的抗血吸虫疫苗是目前血吸虫病防控研究中的热点之一。本实验室在前期免疫蛋白质组学的研究中发现,肌钙蛋白T(troponin T, TnT)可以被日本血吸虫感染10天后的东方田鼠血清和小鼠血清所识别,但不被这两种未感染动物的血清所识别,推测其可能在诱导抗血吸虫感染的免疫应答中具有重要作用。本研究在此基础上对SjTnT基因进行了克隆,分析了该基因的生物学特性,在大肠杆菌中表达并纯化了重组抗原,评估其在小鼠中诱导的免疫保护效果,为深入开展该基因的生物学功能研究,及进一步明确SjTnT重组抗原作为疫苗候选分子的潜力提供了基础。本文根据GenBank中SjTnT基因序列,设计特异引物,利用PCR技术从日本血吸虫28d虫体cDNA中扩增得到特异的DNA片段。测序结果表明其为SjTnT的ORF片段,长度为975bp,编码324个氨基酸,与SmTnT同源性达到90%以上。编码蛋白理论分子量为38.4kDa,理论等电点为6.03,生物信息学分析显示该蛋白二级结构主要为超螺旋,亲水性较强,无信号肽和跨膜结构域,具有较强的抗原性。进一步利用BamH Ⅰ、Sal Ⅰ将SjTnT基因片段定向克隆至pET28a(+)载体中,成功构建了重组表达质粒pET28a(+)-SjTnT,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,并纯化得到重组蛋白。将重组蛋白免疫小鼠,收集血清。Western blotting分析结果表明重组蛋白能被重组蛋白免疫血清识别,说明具有良好的抗原性。利用免疫组化方法观察SjTnT蛋白在虫体中分布情况,结果表明,SjTnT主要分布在日本血吸虫体被表膜,实质器官也有部分分布。纯化制备重组抗原rSjTnT,结合ISA206佐剂免疫BALB/c小鼠,进行小鼠日本血吸虫病免疫保护试验,结果和对照组比较,rSjTnT在BALB/c小鼠中分别诱导了33.89%(P<0.05)的减虫率和43.94%的肝脏减卵率。免疫保护机制研究表明,随着免疫次数的增加,免疫鼠血清中特异性的IgG抗体水平持续升高,IgG1/IgG2a比值呈升高趋势。结果提示,重组蛋白rSjTnT可诱导小鼠产生一定的保护作用,是一种有潜力的抗血吸虫病候选疫苗分子。