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油樟[Cinnamomum longepaniculatum (Gamble) N. Chao]是樟科(Lauraceae)樟属(Cinnamomum)植物,是中国特有树种,为国家Ⅱ级重点保护野生植物,主要产在四川宜宾,在湖北、湖南、陕西、云南、江西、广西、广东等地均有分布。油樟叶含有丰富的芳香油(3.8～4.5%),是香料、医药、日用及化工产品的重要原料来源。为了充分利用油樟资源,本研究探讨了油樟叶各提取物对人肝癌BEL-7402细胞的体外抗肝癌细胞活性,并对筛选出的油樟叶抗肝癌活性有效部位进行抗肝癌机理研究。主要研究结果如下：1油樟叶各提取物的制备：采用系统溶剂法制备油樟叶提取物,即先将油樟叶用水蒸气蒸馏提取挥发油,再将提取挥发油后的油樟叶残渣用95%乙醇连续回流提取,最后用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇逐级萃取。通过以上提取工艺后,依次得到油樟叶挥发油、油樟叶乙醇提取物、油樟叶乙醇提取物石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相和正丁醇萃取相。油樟叶挥发油再通过气相色谱法分离得到五种单体物质：1,8-桉叶油素、黄樟油素、γ-松油醇、a-松油烯和松油烯-4-醇。2油樟叶各提取物对人肝癌BEL-7402细胞的体外抗肝癌活性：本研究采用体外培养细胞四甲基偶氮唑盐(3-4,5-diemethylthiarol-2,5-diphenytetrazolium bromide,MTT)快速比色法观察了油樟叶各提取物对人肝癌BEL-7402细胞的生长抑制情况。结果表明：油樟叶乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、油樟叶挥发油及其主要组成成分1,8-桉叶油素、黄樟油素、γ-松油醇、a-松油烯和松油烯-4-醇对人肝癌细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)分别为：>1280μg/mL、>1280μg/mL、723.5μg/mL、>1280μg/mL、1027.4μg/mL、>1280μg/mL、305.3μg/mL、312.14μg/mL、>1280μg/mL和>1280μg/mL。同时采用软琼脂细胞集落形成实验观察了油樟叶各提取物对人肝癌BEL-7402细胞体外集落形成的抑制情况。结果表明：油樟叶乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、油樟叶挥发油及其主要组成成分1,8-桉叶油素、黄樟油素、γ-松油醇、α-松油烯和松油烯-4-醇对人肝癌细胞体外集落形成率的ICso值分别为：>1280μg/mL、>1280μg/mL1123.4g/mL、>1280μg/mL、1047.6μg/mL、823.4μg/mL、313.7μg/mL、405.3μg/mL773.6μg/mL、和964.5μg/mL。以上研究结果表明:油樟叶各提取物中,黄樟油素和γ-松油醇具有较强的抗人肝癌BEL-7402细胞作用；其次为油樟叶挥发油和乙酸乙酯萃取物；油樟叶乙醇提取物、石油醚萃取物、1,8-桉叶油素、a-松油烯和松油烯-4-醇的体外抗肝癌BEL-7402细胞的作用较差；正丁醇萃取物对人肝癌BEL-7402细胞几乎无抑制作用。3黄樟油素体外抗人肝癌BEL-7402细胞的作用机理研究：光镜和电镜下观察了黄樟油素对人肝癌BEL-7402细胞的形态学影响、流式细胞仪观察了黄樟油素对肝癌细胞的细胞周期和凋亡率的影响、凝胶电泳观察了黄樟油素对肝癌细胞DNA完整性的影响。结果显示：黄樟油素作用之后,人肝癌BEL-7402细胞出现典型细胞凋亡形态学变化。细胞体积缩小,细胞核固缩、凝集；随着黄樟油素作用时间延长,固缩的细胞核逐渐碎裂为细小的团块。通过透射电镜观察到,黄樟油素作用之后,细胞核电子密度降低,核仁出现空泡状结构,同时还会导致细胞内线粒体脊断裂,呈现空泡状。随着作用时间延长,细胞核碎裂,伴随着凋亡小体出现。流式细胞仪分析发现,黄樟油素能将处于分裂期的人肝癌BEL-7402细胞阻滞在在Go/G1期和S期,而进入G2期的细胞数量减少,通过这个途径阻断了细胞的正常分裂增殖。同时,黄樟油素能够诱导BEL-7402细胞发生凋亡。实验发现,黄樟油素作用后的细胞与对照组相比,凋亡率显著增大,且随作用时间的延长,细胞胞凋亡率逐渐增大。黄樟油素作用后,人肝癌BEL-7402细胞DNA发生裂解,在凝胶电泳上表现为条带拖尾,并有典型的阶梯状条带出现。以上研究结果表明：黄樟油素能够从多方面改变人肝癌细胞的正常生理活动,从而起到抗肝癌作用。4γ-松油醇体外抗人肝癌BEL-7402细胞的作用机理研究：光镜和电镜下观察γ-松油醇对人肝癌细胞的形态学的影响、流式细胞仪观察了γ-松油醇对肝癌细胞的细胞周期和凋亡率的影响、凝胶电泳观察了γ-松油醇对细胞DNA完整性的影响。结果显示：光镜下：γ-松油醇作用后,人肝癌BEL-7402细胞变圆、体积缩小,细胞核固缩,细胞核深染,呈现典型的凋亡细胞形态变化；随作用时间延长,细胞结构变化越显著,原本凝结成团的细胞出现核碎裂,细胞内甚至出现空泡状结构。电子显微镜下可观察到细胞双层核膜消失,核内出现异染色质,最后细胞核碎裂,有凋亡小体出现。同时,随着细胞膜的破裂,部分细胞内的细胞器溢出并伴随结构的变化,最显著的是线粒体的脊断裂,后期几乎形成空泡状。γ-松油醇对人肝癌BEL-7402细胞周期的影响表现为：Y-松油醇作用之后,将处在分裂期的人肝癌BEL-7402细胞阻滞在Go/G1期和S期,导致进入G2期的细胞数量减少,阻断细胞正常的分裂增殖。同时,γ-松油醇诱导BEL-7403细胞发生凋亡,且随着作用时间延长,凋亡率逐渐增大。凝胶电泳结果显示：γ-松油醇引起人肝癌BEL-7402细胞DNA的裂解呈时间依赖性。γ-松油醇作用的前24h,细胞DNA几乎没有出现裂解现象；随着作用时间延长,细胞DNA呈现明显的裂解,在凝胶上出现显著的拖尾现象,有不同的条带出现。以上研究结果表明：γ-松油醇能够从多方面改变人肝癌细胞的正常生理活动,从而起到抗肝癌作用。