骨骼肌的形成是一个复杂的过程，包括成肌细胞的增殖、分化和肌管的形成等，这一过程受到一系列的信号分子，如转录因子等的调节。microRNA(miRNA)是动植物中广泛存在的、物种间高度保守的、长度为22个核苷酸左右的一类单链小分子非编码的RNA，在转录或转录后水平调控基因的表达。近年来，随着对microRNA研究的深入，人们发现这类单链小分子RNA参与了骨骼肌发育的调节。Myf6是生肌调节因子MRFs（Myogenic Regulatory Factors）家族的一员，它可以识别并结合于许多肌肉发育相关基因的启动子区域，调控肌肉的发育。本研究鉴定了直接靶定Myf63UTR的microRNAs，主要研究了miR-374b和miR-299对C2C12成肌细胞分化的影响，主要工作及结果如下:　　1.调节Myf6基因的microRNA鉴定　　通过在线软件预测了miR-299、miR-374b、miR-376c、miR-377、miR-499和miR-669f是直接靶定Myf6基因的候选microRNAs。我们构建了482bp的包含有候选microRNAs结合位点的My f63UTR野生型和突变掉miR-299和miR-374b结合位点的Myf63UTR突变型双荧光素酶报告载体。证明了miR-374b能够直接靶定Myf63UTR并调控内源Myf6表达。　　2.miR-374b在肌细胞分化中的作用　　利用Q-PCR分别分析了miR-374b的组织表达谱和miR-374b在成肌细胞分化过程中的表达模式。miR-374b在2月龄C57BL6小鼠心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、脂肪、骨骼肌九个组织广泛表达;miR-374b在C2C12成肌细胞分化的第0h、24h、72h和96h呈先上升后下降的表达趋势。　　我们通过超表达和抑制内源miR-374b表达，研究了miR-374b在C2C12成肌细胞分化过程中的作用。结果显示，在超表达miR-374b后，分化标志基因MyoG的表达量增加，而MyoD和Myf5基因的mRNA水平变化不明显。但western blot检测发现肌球蛋白重链(MyHC)的蛋白水平明显降低，免疫荧光检测也显示细胞融合率下降;相反，转染miR-374b的抑制剂，抑制miR-374b的表达，肌球蛋白重链的蛋白水平明显升高，免疫荧光检测显示细胞融合率上升。因此，我们证实了miR-374b负向调控C2C12成肌细胞的分化。另外，细胞增殖实验显示miR-374b促进C2C12成肌细胞的增殖。　　miR-374b在腓肠肌（混合型肌纤维）中的表达量高于比目鱼肌（慢肌纤维）的表达量。在超表达miR-374b的C2C12细胞中，Myh7（慢肌）和Myh4（快肌）的表达量均有下降，但是Myh7的下降幅度要大于Myh4的下降幅度，说明miR-374b可以同时抑制快肌纤维和慢肌纤维的形成，但是对慢肌的抑制作用更加明显。　　3.miR-299在肌细胞分化中的作用　　同样，我们利用Q-PCR分别分析了miR-299组织表达谱以及miR-299在成肌细胞分化过程中的表达模式。在2月龄C57BL6小鼠心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、脂肪、骨骼肌九个组织中，miR-299广泛表达;miR-299在C2C12成肌细胞分化的第0h、24h、72h和96h，表达量呈上升趋势。　　通过超表达和抑制内源miR-299表达实验，我们研究了miR-299在C2C12成肌细胞分化过程中的作用。结果显示，超表达miR-299后，分化标志基因MyoG，MyoD，My f5的mRNA水平均上升;通过转染miR-299的抑制剂，分化标志基因MyoG，MyoD，My f5的表达量显著均下降。因此，我们证实了miR-299正向调控C2C12成肌细胞的分化。　　本研究首次鉴定出miR-374b和miR-299能够调控成肌细胞分化，从而进一步完善了肌肉发育的microRNA调控网络，为农业生产和肌相关疾病临床治疗提供了一定的理论基础。