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第一部分VEGF基因转染MSCs对脑梗死大鼠模型治疗作用的体外实验目的：观察和检测VEGF基因修饰后的骨髓间充质干细胞在缺血环境下是否具有更强的分泌VEGF的能力,进一步探讨MSCs在缺血性再灌注脑损伤中的作用机制,为临床应用提供可靠依据。方法：直接贴壁法分离培养MSCs,脂质体转染法将pIRES2-EGFP-VEGFA真核表达载体导入MSCs,光密度值法及流式细胞术测其转染率,Western Blot检测转染前后细胞内VEGF基因的蛋白表达。线拴法制作SD大鼠左侧短暂性大脑中动脉栓塞模型。尾静脉注射法移植MSCs。ELISA法检测大鼠脑组织以及MSCs培养体系中VEGF水平。结果：pIRES2-EGFP-VEGFA真核表达载体转染MSCs后48h在荧光显微镜下观察,可见带绿色荧光的细胞,光密度值法测其转染率为(28±3.4)%,流式细胞术测其转染率为(32±2.8)%。Western Blot检测证实VEGF基因水平在转染后的MSCs中较转染前有更高表达。移植MSCs后脑缺血大鼠脑组织VEGF水平较未移植组明显升高。体外实验结果显示,添加了缺血性脑组织提取液的MSCs培养体系中VEGF水平较未添加组明显上升,VEGF基因修饰MSCs后其上升趋势更为显著。结论：我们的实验数据显示,缺血环境可促进MSCs分泌VEGF,经VEGF基因修饰后MSCs分泌VEGF的能力得到进一步加强。第二部分VEGF基因转染MSCs对脑梗死大鼠模型的血管新生作用目的：本部分实验旨在大鼠MCAOI/R模型中证实VEGF基因修饰的MSCs移植对其具有血管新生作用,并对脑梗死后血管新生的机制进行初步探索。方法：SD大鼠随机分为假手术组,模型组,MSCs组和VEGF-MSCs组。线拴法制作tMCAO/R模型,MSCs组大鼠脑梗死后一天经尾静脉注射2×106个MSCs,VEGF-MSCs组大鼠脑梗死后一天经尾静脉注射2×106个转染VEGF基因的MSCs。ELISA法测各组大鼠脑组织VEGF水平表达。免疫组化法观察梗死区周边Ang-2及CD34的表达,Western-blot法测梗死区周边Ang-2的蛋白表达。透射电镜观察脑梗死后大脑皮层血管间隙及水肿情况。结果：ELISA结果显示,模型组大鼠梗死后脑组织VEGF表达水平升高并且在4d左右达到高峰,7-10d时回落至假手术组(正常)水平甚至更低；与模型组相比,VEGF-MSCs组和MSCs组在各个时间点VEGF水平都要明显高于模型组(P<0.05),且VEGF-MSCs组较MSCs组更高(P<0.05),在第10d时仍维持较高水平。免疫组化的结果提示,梗死10d后VEGF-MSCs组和MSCs组梗死区周边Ang-2阳性细胞数及CD34的表达均明显多于模型组(P<0.05),且VEGF-MSCs组较MSCs组更高(P<0.05),Western-blot结果也显示出同一趋势。透射电镜可以观察到脑梗死后大脑皮层血管间隙明显增宽,水肿明显。结论：VEGF基因转染的MSCs移植tMCAO模型大鼠与移植MSCs组相比,更能提高脑梗死后梗死侧脑组织VEGF的浓度,上调Ang-2水平,增加梗死区周边微血管密度。我们推测VEGF与Ang-2的协同作用,可能是脑缺血后血管新生的机制之一。第三部分VEGF基因转染MSCs对脑梗死大鼠模型的神经保护作用目的：本实验旨在通过观察脑梗死后及MSCs,VEGF-MSCs移植tMCAO/R模型大鼠后一系列检测指标的变化,证实VEGF基因修饰的MSCs移植对tMCAO/R模型大鼠具有神经保护作用,并对脑梗死后神经保护的机制进行探讨。方法：SD大鼠随机分为假手术组,模型组,MSCs组和VEGF-MSCs组。NSS评分法对各组大鼠各个时间点进行行为学评分。TTC法测各组大鼠的脑梗死体积。TUNEL原位细胞凋亡检测脑梗死后各组大鼠梗死区边缘神经元细胞凋亡数量。透射电镜观察梗死侧皮层神经元细胞线粒体及突触的变化。冰冻切片免疫荧光法观察梗死侧皮层神经元的变化。免疫组化法观察各组大鼠脑组织Caspase-3阳性细胞表达,Western blot分析各组大鼠脑组织Caspase-3蛋白表达水平。实时荧光定量PCR技术对各组大鼠各个时间点Bcl-2mRNA转录水平进行分析。结果：假手术组(正常)NSS评分为0,未见脑梗死,偶见生理性凋亡细胞(数据未显示)。VEGF-MSCs和MSCs组在4d,7d,10dNSS评分明显低于模型组(P<0.05),其中,VEGF-MSCs较MSCs组要更低(P<0.05)。TTC结果显示梗死10d后VEGF-MSCs组和MSCs组的脑梗死体积明显低于模型组(P<0.05),VEGF-MSCs组较MSCs组要更低(P<0.05),TUNEL检测结果也显示出同样的趋势。透射电镜结果显示脑梗死后神经元细胞线粒体肿胀变形,VEGF-MSCs组和MSCs组这种变化较轻,但两组之间区别不大。脑组织梗死侧大脑皮层冰冻切片免疫荧光可见脑梗死后神经元细胞大量丢失,神经元之间的突触联系减少,VEGF-MSCs组和MSCs组这种改变也较轻。免疫组化及Western blot的结果都显示,VEGF-MSCs组和MSCs组大鼠脑组织Caspase-3阳性细胞表达数及蛋白表达水平要明显低于模型组(P<0.05),其中VEGF-MSCs组较MSCs组更低(P<0.05)。实时荧光定量PCR的结果显示脑梗死后Bcl-2mRNA转录水平升高,VEGF-MSCs组和MSCs组与模型组相比升高得更明显(P<0.05),其中,VEGF-MSCs组较MSCs组要更高(P<0.05)。结论：VEGF基因修饰的MSCs移植tMCAO/R模型大鼠,可减少脑梗死体积,减少神经元细胞凋亡数量,改善神经功能。VEGF神经保护作用其机制可能为VEGF促进脑组织内血管新生改善脑缺血区微环境以及移植后上调Bcl-2基因表达,抑制Caspase-3有关。,