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产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是人兽共患李斯特菌病的病原,主要通过食用被LM污染的食品感染,能引发人的脑膜炎、发热性败血性胃肠炎、孕妇流产等,感染后发病死亡率约为25%。欧美国家曾多次暴发流行,LM对食品的污染与危害,已引起世界各国的普遍关注和高度重视,其中研制预防李斯特菌病的减毒活疫苗是重要的课题之一。另一方面,鉴于LM是胞内寄生菌,减毒LM是非常有前景的疫苗载体之一。为此,本研究通过同源重组的方式对血清型为1/2a的野生型菌株基因组中相邻的两毒力基因actA和plcB进行缺失,获得减毒重组菌株,并以减毒株开展了以原核和真核表达的不同方式运送模式蛋白GFP的研究。为了对减毒株的免疫保护力进行评价,以及从不同水平上证实基因的缺失,对毒力基因hly和actA在大肠杆菌中进行了原核表达并对ActA蛋白进行了单抗的研制。减毒突变株的获得不仅对李斯特菌病的预防具有重要作用,而且为构建预防人类和动物疫病的疫苗载体奠定了基础。此外,对于LM阐明毒力因子的致病机理与免疫保护作用提供了条件。1.产单核细胞李斯特菌actA基因和hly基因的原核表达及ActA单克隆抗体的研制利用PCR技术从血清型1/2a的LM4株中扩增出actA基因,经克隆筛选和测序鉴定后,构建成该基因的原核表达载体pGEX-6P-1-actA及pET-actA,转入终宿主菌E.coli后,IPTG诱导目的蛋白的表达。SDS-PAGE电泳结果表明,actA基因在两种载体中均获得表达,融合蛋白的大小分别约为120KD和97KD。