研究背景细菌生物膜是指细菌粘附于有生命或无生命的物质表面后,由细菌及其所分泌的胞外多聚物共同组成的呈膜状的细菌群体,是细菌相对于悬浮状态的一种群体生活方式。生物膜作为一种生物屏障,可使存在于其中的菌体(被膜菌)相对于其单个悬浮状态的菌体(悬浮菌)对抗菌药物表现出更强的抗性。据美国国立卫生研究院的统计,约80%人类慢性感染性疾病是由细菌生物膜的形成引起的。病原菌持续存在,导致慢性持续性感染或感染反复发作,是临床上一大难题,为临床抗感染治疗带来挑战。清开灵注射液由胆酸、珍珠母(粉)、猪去氧胆酸、栀子、水牛角(粉)、板蓝根、黄芩苷、金银花等中药提取物组成,具有清热解毒、化痰通络、醒神开窍等功能,多用于治疗热病、神昏、中风偏瘫、神志不清、急性肝炎及上呼吸道感染等症,尤其对呼吸道感染有较好的治疗效果。目前虽然有一些关于清开灵注射液抗悬浮状态细菌的研究,但在临床上,致病菌大多以细菌生物膜的形式存在,因此,仅仅以杀灭悬浮细菌的量做为指标衡量其抗菌作用是不全面不客观的。本研究在前期研究的基础上,探讨清开灵注射液细菌生物膜的影响及其可能的作用机制。目的本研究探讨清开灵注射液对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌、大肠埃希菌细菌生物膜的作用,并探讨清开灵注射液抗金黄色葡萄球菌细菌生物膜的可能作用机制,为临床上清开灵治疗细菌感染性疾病提供实验依据,为抗菌中药的作用机理研究和药效评估提供新途径。方法第一部分清开灵注射液对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌细菌生物膜的作用微孔板法建立金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌细菌生物膜形成期及成熟期模型。分别设立对照组、清开灵注射液组、青霉素组(或甲氧西林组),给药后37℃,作用24小时。结晶紫染色,检测药物对细菌生物膜总量的抑制作用;WST或者XTT检测药物对细菌生物膜内活菌的抑制作用。第二部分清开灵注射液抗金黄色葡萄球菌细菌生物膜的作用机制探讨1.滤膜上培养成熟细菌生物膜,设立对照组、清开灵注射液组、青霉素组,给药后37℃作用24小时。移入含有青霉素的LB平板,生物膜面向上,在生物膜上覆盖同样大小的滤膜,形成细菌生物膜三明治结构。在三明治结构上放入培养液润湿的滤纸片,37℃作用4h。将滤纸片移入涂布有金葡菌的LB平板,37℃作用18-24h,观察抑菌效果。将透过细菌生物膜的抗生素作为衡量指标,反映细菌生物膜完整性,同时间接评价处理因素的作用。2.数控剪切流活细胞自动分析平台培养成熟细菌生物膜,设立对照组、清开灵注射液组、青霉素组,分别在0min,10min,20min,30min,1h,3h,4h,7h拍照,实时观察给药后药物对细菌生物膜的作用。3.6孔板内放置玻璃片培养成熟细菌生物膜,设立对照组、清开灵注射液组、青霉素组。药物处理后,制备扫描电镜样本,扫描电镜下观察药物对细菌生物的破坏作用。4.15mL离心管内培养成熟细菌生物膜模型,设立对照组、清开灵注射液组、青霉素组。药物处理后,制备透射电镜样本,透射电镜下观察药物对细菌超微结构的作用。结果第一部分清开灵注射液对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌细菌生物膜的作用1.对于形成期金黄色葡萄球菌细菌生物膜,与对照组相比,清开灵注射液浓度在22500-352mg/L范围内能够减少生物膜总量及生物膜内活菌量,青霉素浓度在20-0.039mg/L范围内能够减少生物膜总量及生物膜内活菌量。对于成熟期金黄色葡萄球菌细菌生物膜,与对照组相比,清开灵注射液浓度在22500-44mg/L范围内对生物膜总量无作用,而浓度在22500-1406mg/L范围内能够减少生物膜内活菌量,青霉素浓度在20-0.039mg/L范围内对生物膜总量及生物膜内活菌量无作用。2.对于形成期耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细菌生物膜,与对照组相比,清开灵注射液浓度在22500mg/L时能够减少生物膜总量,在22500-11250mg/L时能够减少生物膜内活菌量。甲氧西林浓度在20-10mg/L时能够减少生物膜总量,在20mg/L时能够减少生物膜内活菌量。对于成熟期耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细菌生物膜,与对照组相比,清开灵注射液对生物膜总量无作用,而浓度在22500-2813mg/L范围内能够减少生物膜内活菌量。甲氧西林浓度在20-0.039mg/L对生物膜总量及生物膜内活菌量无作用。3.对于形成期及成熟期铜绿假单胞菌、大肠埃希菌细菌生物膜,与对照组相比,清开灵注射液浓度在25000-44mg/L对生物膜总量及生物膜内活菌量无作用。青霉素浓度在20-0.039mg/L对生物膜总量及生物膜内活菌量无作用。第二部分清开灵注射液抗金黄色葡萄球菌细菌生物膜的作用机制探讨1.空白对照组无抑菌圈,说明LB平板中青霉素未渗透入细菌生物膜;清开灵组有抑菌圈,说明LB平板中青霉素渗透入细菌生物膜,间接说明清开灵注射液能够破坏细菌生物膜;青霉素组均无抑菌圈,说明LB平板中青霉素未渗透入细菌生物膜,间接说明青霉素未能破坏细菌生物膜。2.数控剪切流活细胞自动分析平台可见,清开灵注射液组给药20 min后,细菌生物膜的光密度明显下降。给药1-3h,生物膜出现松散迹象,生物膜逐渐散开,;完整结构被破坏,贴管壁生长的致密团块逐渐变为悬浮细菌。给药4-7h,贴管壁生长的细菌生物膜完全散开,管腔内充满悬浮的细菌。而青霉素组无明显变化,细菌生物膜贴管壁生长,结构完整,并未被破坏,管腔内悬浮细菌少。说明清开灵注射液可以破坏成熟细菌生物膜完整结构,使细菌处于悬浮状态,而青霉素无此作用。3.扫描电镜对照组可见细菌生物膜内细菌排列紧密,大小均一,细菌结构完好,未见明显死亡菌体,胞外基质包绕细菌表面并分布于细菌之间,为典型细菌生物膜结构。清开灵注射液组,细菌生物膜结构疏松,细菌大小不等,可见体积明显增大的菌体,以及细菌肿胀破裂内容物渗出后干瘪的菌体,可见少量胞外基质分布于细胞间。青霉素组细菌形态基本正常,细菌生物膜结构较稀疏,生物膜表面细菌排列混乱。4.透射电镜可见对照组细菌细胞壁完整光滑,胞质分布均匀,分裂期细菌新生细胞壁清晰可见。清开灵注射液组细菌细胞壁模糊不清,胞质分布不均,聚集成团,甚至胞质分离,仅剩模糊不清的细胞壁。青霉素组细菌细胞壁基本完整,分裂期细菌新生细胞壁模糊不清,胞质内可见深染物质。结论在金黄色葡萄球菌以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细菌生物膜形成期,清开灵注射液能够减少生物总量及膜内活菌量,抑制了细菌生物膜的粘附;而在其成熟期,清开灵注射液对生物膜总量并无作用,但可以减少生物膜内活菌量。推测清开灵注射液透过成熟的细菌生物膜进而发挥抗菌作用,杀死生物膜内细菌。清开灵注射液抗菌机制与青霉素抗菌机制不同。清开灵注射液增加药物对细菌生物膜渗透,破坏细菌生物膜完整结构,进而损伤生物膜内细菌细胞质与细胞壁,导致细菌死亡。清开灵注射液具有破坏细菌生物膜作用,同时能够引起膜内细菌死亡,但导致细菌死亡的作用位点有待进一步研究。