肾间质纤维化是各种原因所致肾脏疾病进展至终末期肾功能衰竭的共同病理特征。由于血管活性物质、细胞因子等因素的作用，导致细胞外基质合成和降解失衡，大量积聚于肾脏是引起肾间质纤维化的主要原因。肾间质纤维化与肾小球的功能密切相关，故深入研究肾间质纤维化的机理，对于慢性肾脏疾病的治疗有着重要的意义。 肾上腺髓质素是近年来新发现的血管活性肽，具有降低血压、保护靶器官等作用，大量的试验研究还证实其可以拮抗血管紧张素Ⅱ，可以抑制细胞增殖，抑制转化生长因子的异常表达，减少细胞外基质的过度沉积等，而且是体内自身分泌的物质，在肾脏病的治疗中有着很好的前景。 中医药在长期治疗肾脏病的过程中积累了丰富的经验，尤其是活血药物的使用，可以改善患者肾脏的血液循环，增加肾小球滤过率，抑制血管活性物质和细胞因子的异常表达，加快细胞外基质的降解，通过多途径、多靶点实现保护肾功能的作用，被广泛的应用于肾脏临床。然而对肾小管损伤及间质纤维化的干预治疗研究尚存在很多不明之处，影响了临床的广泛使用，有必要进行深入研究。以往的研究结果是否与肾上腺髓质素的表达有关，对其受体的作用如何是本课题的研究重点。 目的：本实验采用肾上腺髓质素基因敲除小鼠和SD大鼠，结扎单侧输尿管，观察在基因缺失状态下肾脏形态损伤、转化生长因子和细胞外基质与野生小鼠的不同之处。在此基础上，观察红花对单侧输尿管结扎诱导的肾间质纤维化大鼠模型的作用，了解对肾上腺髓质素及其受体表达的影响，对实验动物梗阻侧肾脏病理形态学以及转化生长因子β1、Ⅲ型胶原的影响，探讨中药红花对肾间质纤维化的拮抗作用及作用机理。 第一部分肾上腺髓质素基因敲除小鼠间质纤维化损伤的形态学改变 HE染色结果：野生小鼠假手术组小鼠肾脏组织切片表现未见异常，上皮细胞排列正常，无细胞水肿。模型组肾组织切片表现为因水肿造成肾脏皮质和髓质间隙增宽，近曲小管上皮细胞水肿、远曲小管扩张，上皮细胞缺失、坏死及细胞管型形成。在缬沙坦治疗组肾脏损伤表现仍然严重，但优于模型组。肾上腺髓质素基因敲除小鼠假手术组肾脏病理切片未见异常表现，与野生小鼠表现一致。模型组细胞损伤程度稍重于野生小鼠，细胞坏死程度明显，小管扩张严重。缬沙坦治疗组优于模型组但与野生小鼠比较无显著性差别。 Masson染色结果：野生小鼠假手术组小鼠肾脏无异常；模型组小管扩张，小管基底膜变薄，并出现了小管萎缩，间质胶原成分明显增多；缬沙坦治疗组胶原成分增多但较模型组为轻。肾上腺髓质素基因敲除小鼠假手术组与野生小鼠相同，无明显异常改变，纤维成分未见增多。单侧输尿管结扎模型组除小管扩张和萎缩外，胶原成分显著增加，明显多于野生小鼠。缬沙坦治疗组较模型组有好转但较野生小鼠损伤严重。 第二部分转化生长因子β1在基因敲除小鼠肾间质纤维化动物肾脏的表达 采用免疫组织化学、原位杂交和RT-PCR方法测定TGF-β1在野生小鼠及基因敲除小鼠中的异同。 1.TGF-β1蛋白表达结果假手术组TGF-β1免疫组化测定结果显示野生小鼠肾小管上皮细胞及肾小球均呈弱阳性表达；肾上腺髓质素基因敲除小鼠表达增强；野生小鼠单侧输尿管结扎组TGF-β1的表达明显增强，主要在肾小管上皮细胞，部分间质细胞亦有表达；基因敲除小鼠结扎单侧输尿管后，TGF-β1的表达较野生小鼠更为显著，尤其是肾小管上皮细胞，亦可见到在间质细胞和肾小球系膜细胞的过度表达，呈片状或条索状。两组小鼠经缬沙坦治疗后，均有不同程度的减弱。记分结果显示，野生小鼠假手术组为0.73±0.09，UUO组为1.93±0.12，与假手术组相比有显著性差异(p＜0.01)；治疗组为1.40±0.09，与UUO组相比有显著性差异(p＜0.01)。肾上腺髓质素基因敲除小鼠假手术组为1.2±0.09,与野生小鼠假手术组相比有显著性差异(p＜0.01)；UUO组表达明显增强，记分为2.50±0.12，无论与基因敲除小鼠假手术组还是野生小鼠UUO组相比，都有显著性差异(p＜0.01)；治疗组为1.48±0.09，与UUO组相比有显著性差异(p＜0.01)，但与野生小鼠治疗组相比无显著性差别。 第三部分Ⅲ型胶原在肾上腺髓质素基因敲除小鼠肾脏中的表达 Ⅲ型胶原免疫组化表达结果：野生小鼠和基因敲除小数假手术组肾脏中，仅有微量表达；结扎输尿管后，Ⅲ型胶原的沉积明显增多，基因敲除小鼠尤为明显，治疗组较模型组有所下降。Ⅲ型胶原主要沉积在小管间质区，呈条索状或块状样沉积。采用评分法统计，野生小鼠假手术组、模型组、治疗组分别为0.34±0.09，0.73±0.12和0.46±0.09，其中模型组与假手术组相比有显著性差异(p＜0.001)；缬沙坦治疗组与模型组相比有Ⅲ型胶原的沉积但较轻，也有显著性差异(p＜0.01)。基因敲除小鼠假手术组、模型组及治疗组的评分结果分别是0.43±0.08，0.95±0.16和0.55±0.12，其中模型组与假手术组相比有显著性差异(p＜0.01)；缬沙坦治疗组与模型组相比有Ⅲ型胶原的沉积但较轻，也有显著性差异(p＜0.01)。基因敲除小鼠假手术组与野生小鼠假手术组相比无显著性差异，模型组相比有显著性差异(p＜0.05)，治疗组之间未见显著性差异。RT-PCR测定结果显示：Ⅲ型胶原在野生小鼠及肾上腺髓质素基因敲除小鼠假手术组呈弱表达，结扎单侧输尿管后表达明显增强，其中基因敲除小鼠较野生小鼠有显著性增强。给以缬沙坦治疗后，其表达有不同程度的下调。 第四部分红花对肾间质纤维化大鼠肾脏肾上腺髓质素及其受体的影响 肾上腺髓质素免疫组化测定结果：肾上腺髓质素在假手术组表达较为广泛，在皮质及髓质均有表达且以髓质表达为明显，主要表达于肾小管上皮细胞胞浆，测定其阳性表达面积为3288±1912um，积分光密度为4.65±1.44；UUO组肾上腺髓质素的表达明显减弱，在髓质肾小管上皮细胞无阳性表达，仅在皮质部分区域有微弱表达，测定其阳性面积为1384±1053um，与假手术组相比有显著性差异(p=0.002)；积分光密度为1.17±0.39，与假手术组相比有显著性差异(p＜0.001)。红花组肾上腺髓质素的表达明显增强，在皮质及髓质的肾小管上皮细胞胞浆广泛表达，肾小球有微量表达，测定阳性表达面积为5431±1929um，积分光密度为5.34±1.78，与UUO组相比均有显著性差异(p＜0.001)；与假手术组相比虽有增高但无显著性差异(p=0.181)。缬沙坦组阳性面积为2513.7±232.1，明显高于UUO组，有显著性差异(p＜0.01)，但明显低于红花组(p＜0.001)；积分光密度为4.17±0.23，与UUO组无显著性差别但明显低于红花组(p＜0.05)。 第五部分红花对转化生长因子β1及Ⅲ型胶原表达的影响 TGFβ1蛋白的测定结果：免疫组化测定结果显示，在假手术组大鼠肾脏，TGFβ1蛋白主要表达在肾小管上皮细胞及肾小球内，亦可见于肾间质细胞，呈弱阳性表达，阳性面积测定为1839.92±863.82um2,积分光密度为7.90±2.55；与假手术组比较，其余各组表达显著增强，肾小管上皮细胞及间质细胞均有强表达，肾小球内的表达也明显增强，其中，模型组与假手术组相比TGF-β1的阳性面积(20598.58±7115.06)及积分光密度值(59.66±16.01)均呈显著性升高(P＜0.01)；红花组TGF-β1的阳性面积(12942±4453.91)及积分光密度值(46.31±11.27)与模型组相比均显著性下降(P＜0.05)；缬沙坦组与模型组相比，TGF-β1的阳性面积(11770.08±5035.51)及积分光密度值(45.02±13.13)亦明显降低，有显著性差别(P＜0.05)，提示红花和缬沙坦均可抑制梗阻侧肾组织中TGF-β1的蛋白表达；其中红花组较缬沙坦表达稍强，但统计学处理无显著性差异(P＞0.05)。 结论：综合以上结果进行分析可得到以下结论： 1.肾上腺基因敲除小鼠结扎单侧输尿管所导致的间质损伤较野生小鼠明显。 2.梗阻性肾病肾组织中TGFβ1的表达明显上升，肾上腺髓质素基因敲除小鼠尤为明显，血管紧张素转换酶抑制剂可部分下调其表达。 3.肾上腺髓质素可以抑制细胞外基质的异常沉积，基因缺失小鼠与野生小鼠相比，肾间质损伤后有显著性不同。 4.红花可以促进肾上腺髓质素及其受体在蛋白水平的表达。红花可以上调肾上腺髓质素mRNA的表达。 5.红花和缬沙坦可在蛋白及基因水平抑制单侧输尿管结扎导致肾间质纤维化所出现的TGFβ1的高表达。 6.红花能够减少单侧输尿管结扎导致的肾间质纤维化大鼠肾脏的Ⅲ型胶原的沉积。