miR-16是具有肿瘤抑制功能的miRNA之一,在慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌等多种肿瘤中表达下调。为研究miR-16对机体抗肿瘤免疫功能的影响,课题组前期从美国Jackson实验室引进miR-15a/16^-/-基因敲除小鼠,对其免疫细胞表型分析发现,生理状态下miR-15a/16^-/-小鼠脾脏中巨噬细胞的功能无明显变化,而在H22肝癌细胞荷瘤状态下miR-15a/16^-/-小鼠体内巨噬细胞频率显著减少,活性发生改变。本研究进一步对miR-15a/16^-/-小鼠CD8⁺T细胞的表型及功能进行了测定,并以DSS诱导的小鼠肠炎模型评价该小鼠体内CD8⁺T细胞的功能。研究内容分为3个部分:1.miR-15a/16^-/-小鼠CD8⁺T细胞的活性分析目的:明确miR-15a/16^-/-小鼠CD8⁺T细胞的功能是否发生变化。方法:分离miR-15a/16^-/-小鼠与C57BL/6小鼠脾脏并制备脾脏单细胞悬液,通过流式细胞术分别检测 CD8⁺NKG2D⁺、CD8⁺CD44⁺、CD8⁺CD44⁺CD62L-、CD8⁺CD25⁺CD69⁺细胞的频率。以PMA/Ionomycin刺激小鼠CD8⁺T细胞后,胞内染色法检测CD8⁺T细胞IFN-γ的产生能力。同时,CD8⁺T细胞与MC-38细胞共孵育后以CD107a标记法检测CD8⁺T细胞的脱颗粒活性。结果:与对照组C57BL/6小鼠相比,miR-15a/16^-/-小鼠脾脏来源的CD8⁺CD25⁺CD69⁺、CD8⁺CD44⁺、CD8⁺NKG2D⁺、CD8⁺CD44⁺CD62L-T细胞的频率显著增高,且该小鼠脾脏来源的CD8⁺T细胞脱颗粒活性增强。结论:miR-15a/16基因敲除上调小鼠脾脏CD8⁺T细胞的频率,并增强其生物学活性。2.miR-15a/16^-/-小鼠CD8⁺T细胞对DSS-肠炎发病的影响目的:明确miR-15a/16^-/-小鼠体内CD8⁺T细胞活性的增强是否参与DSS-肠炎小鼠的发病。方法:以2.5%DSS喂养miR-15a/16^-/-小鼠和对照C57BL/6小鼠,诱导其肠炎的发生,观察并记录小鼠的体重、腹泻、便血等情况,计算小鼠肠炎的疾病活性指数（DAI）。通过流式细胞术检测miR-15a/16^-/-小鼠和对照C57BL/6小鼠脾脏和肠道中CD8⁺NKG2D⁺T细胞的频率。记录小鼠肠道组织的炎症发生情况,并制备小鼠肠道组织切片,利用H&E染色法,观察小鼠肠道组织的病理学变化。利用免疫组织化学等方法检测小鼠肠道组织内CD8⁺T细胞的浸润情况。结果:与对照组C57BL/6小鼠相比,miR-15a/16^-/-小鼠经2.5%DSS喂养后体重及体重指数显著下降。且miR-15a/16^-/-小鼠疾病活性指数（DAI）显著高于对照小鼠,表现为便血情况的加剧和小鼠肠道的显著缩短等。同时,miR-15a/16^-/-肠炎小鼠肠道组织中CD8⁺T细胞、中性粒细胞等炎性细胞浸润量显著高于对照小鼠,其中CD8⁺T细胞高表达NKG2D分子。此外,miR-15a/16^-/-肠炎小鼠脾脏中CD8⁺NKG2D⁺T、CD8⁺IFN-γ⁺细胞的频率也显著高于对照小鼠。结论:miR-15a/16基因敲除加剧DSS诱导的小鼠肠炎发病,miR-15a/16^-/-肠炎小鼠肠道组织中有大量CD8⁺T细胞的浸润,且高表达活化型分子NKG2D。3.miR-16对小鼠CD8⁺T细胞生物学活性发挥的影响目的:初步探讨小鼠CD8⁺T细胞活性变化是否由miR-16调控。方法:制备C57BL/6小鼠脾脏单细胞悬液,磁珠分选脾脏CD8⁺T细胞,经pre-miR-16或anti-miR-16慢病毒感染72小时后,以流式细胞术检测其表面分子NKG2D的表达情况。并以PMA/Ionomycin刺激后,检测CD8⁺T细胞IFN-γ的产生情况。结果:使用pre-miR-16慢病毒体外感染C57BL/6小鼠脾脏CD8⁺T细胞后,GFP⁺CD8⁺T细胞表面NKG2D分子表达下调,而anti-miR-16慢病毒感染后,GFP⁺CD8⁺T细胞表面NKG2D分子表达上调。与空白对照组相比,过表达miR-16后,GFP⁺CD8⁺T细胞IFN-γ分泌功能减弱,而敲低miR-16后,GFP⁺CD8⁺T细胞IFN-γ分泌功能显著增强。结论:miR-16可能通过调控NKG2D的表达影响CD8⁺T细胞的功能。