由玉蜀黍大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)引起的玉米大斑病是玉米生产上的重要病害之一,常造成严重经济损失。研究表明,MAPK信号转导途径是真菌中普遍存在的细胞外信号转导途径,并对植物病原真菌的生长、发育和致病性有重要的调控作用。本论文通过基因敲除技术创制STK2基因的缺失突变体来研究玉米大斑病菌MAPK信号转导途径中STK2基因的功能。初步明确了玉米大斑病菌信号转导途径中的STK2基因在玉米大斑病菌分生孢子发育、附着胞形成、致病性及次生物质代谢调节等方面的重要功能,为研究其他信号转导调控基因提供了思路和方法。根据实验室前期已克隆得到的STK2基因的DNA序列分别设计5’和3’特异性引物,以玉米大斑病菌基因组DNA为模板,利用Genome walking技术得到了STK2的DNA侧翼序列,最终得到了STK2基因5’端1 951 bp、3’端1 062 bp的非编码区,使用国际上通用的启动子分析软件Sofeberry、NNPP对其进行启动子活性区域分析,结果发现,在起始密码子前1056 bp左右范围内有强的启动子和增强子活性结构,其中在起始密码子前356 bp和1 562 bp处存在CAAT BOX,没有发现TATA BOX,存在3个GpC岛。另外利用生物信息学软件对STK2基因编码的蛋白进行结构及功能预测。根据基因同源重组原理,以潮霉素磷酸转移酶基因取代STK2基因的部分编码区序列,构建了含有潮霉素B抗性标记的STK2基因敲除载体。利用重组DNA片段通过PEG介导转化玉米大斑病菌原生质体,获得了潮霉素B抗性转化子,通过潮霉素磷酸转移酶基因特异性引物和STK2基因特异性引物对转化子进行PCR筛选,并以潮霉素基因为探针进行Southern blot验证,最终确定1个转化子为突变体,命名为Δstk2。对突变体菌株Δstk2进行了表型分析,结果显示,Δstk2菌株菌丝呈白色、气生菌丝稠密,菌落低矮,菌落中部菌丝呈灰白色毡状,其生长速率明显大于野生型。生物测定结果表明,该菌株的HT-毒素对感病寄主叶片的毒力显著下降;突变菌株在洋葱表皮上不能够萌发产生附着胞进而不能侵入洋葱表皮;取其菌盘接种于感病寄主叶片,不能导致寄主发病;此外,突变体菌株对高渗胁迫的耐受能力不及野生型菌株。PCR扩增STK2基因的ORF,将其克隆到穿梭质粒pPIC9K中,转化DH5α,经PCR和测序鉴定后,提取测序正确的pPIC9K-STK2重组载体质粒,线性化后电击转化GS115毕赤酵母菌株,使用G418筛选出稳定表达的酵母重组子,经PCR验证正确后,用甲醇诱导酵母重组子,表达产物经SDS-PAGE分析后推测有目的蛋白的表达,为下一步Western Blot鉴定以及蛋白活性检测奠定基础。根据MAPKK基因核苷酸序列的保守区域设计简并引物,以玉米大斑病菌01-23菌株的DNA为模板,通过PCR技术获得MAPKK基因的部分片段,命名为STKK2,Southern杂交表明,STKK2基因在病菌基因组中以单拷贝形式存在。