乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,也是导致女性死亡最主要的恶性肿瘤之一,90%以上的乳腺癌患者死亡原因都归因于早期浸润和远处转移。乳腺癌常转移至骨、肺、肝和脑,软组织和骨转移者的生存时间是22～26个月,肺和胸膜转移者为10～12个月,肝和脑转移者更短,只有4-6个月。目前对于乳腺癌的发病机理尚未完全清楚,分子生物学研究其发生发展的分子基础是一个多基因长期参与、变异、多阶段积累及相互作用的复杂过程,如果能够针对癌症特异性的分子结构进行针对性靶向性治疗,建立相应的阻断途径来控制其增殖、转移、凋亡是降低死亡率的希望所在,也将会大幅度改善其治疗效果。miRNA是一类内源性非编码单链小RNA分子,长度约22～25核苷酸(nt)并在细胞中高度保守。它主要是通过直接与靶基因的3’非编码区(3’-UTR)结合从而发挥调节作用,miRNA的异常表达与肿瘤的发生发展有关也已被许多研究所证实。得到注解的miRNA中约50%在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点(fragilesite)。越来越多的实验也证实了miRNA对多种细胞生物学行为发挥调节作用,从而在肿瘤的发生及发展中起着相关重要的作用,例如：细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡、个体发育等。由于研究结果表明miRNA在肿瘤中可以作为抑制因子亦或是促癌因子发挥作用,为了能进一步的了解、认清miRNA在疾病中的分子作用机制,研究者们将研究方向扩展到了对miRNA所调控的下游靶基因。一个miRNA分子对于靶基因的调控可能是同时多个的,靶基因也可同时受到多个miRNA的调控,因此研究单个异常表达的miRNA对于其在各种肿瘤的发生、所充当的角色和作用起着及其重要的作用,也是肿瘤miRNA分子靶向治疗的研究关键。miR-32位于基因C9orf5的第14个内含子中, miR-32的生物学作用研究集中在肿瘤、病毒复制、以及雄性激素的调控等。Lecellier等证实miR-32可以限制I型反转录灵长类泡沫病毒在人细胞中的积累,抑制PFV-1的复制,与病毒复制关系密切。当miR-32过表达时,可以促进雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCaP的生长。miR-32还可通过直接调控BTG2基因的表达减少凋亡,从而发挥生物学功能；上调miR-32还可抑制诱导凋亡蛋白PIK3IP1的表达,调控Ser/Thr蛋白激酶MAP2K,以一种共同的信号转导成份在多种不同的信号转导途径中充当重要角色,在细胞生长与分化,炎症与细胞凋亡等应激反应,血管内皮细胞增殖和新血管生成等许多过程中发挥重要的调控作用。miR-32在肿瘤中具有组织特异性,在一些肿瘤中呈现表达上调,在另外一些肿瘤则呈现异常低表达；例如,在肺癌中呈显著低表达；相反,在前列腺癌组织、肾癌组织中miR-32明显高表达,且miR-32表达水平与患者的预后相关。其与肿瘤转移、恶性演进的关系尚待进一步研究。由此看来,miR-32在不同的肿瘤类型中可能发挥不同的作用。至今还未发现miR-32在乳腺癌中的相关报道。FBXW7是F-box蛋白家族成员,在泛素-蛋白酶体系统(UPP)中因特异性地识别降解底物蛋白,从而在细胞周期调控、转录调控、细胞凋亡和细胞信号转导中发挥着重要的作用。研究表明FBXW7是一个广泛的抑癌基因,该基因突变和缺失会导致染色体不稳定,引起与加快癌细胞增殖相关的Myc、CyclinE和Aurora-A的蓄积从而引起肿瘤的发生,其异常表达与胃癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、神经胶质瘤等多种肿瘤有关。FBXW7的研究对肿瘤发生机制理解具有重要意义,同时为肿瘤诊断及治疗提供新的靶点。本课题首先通过生物信息学对基因表达谱数据(GSE 45666)为分析材料,采用Qlucore Omics Explorer软件对miR-32在乳腺癌组织和癌旁正常组织的表达进行分析。并结合临床病例,实时荧光定量PCR技术检测miR-32在乳腺癌组织及癌旁正常组织中的表达。其次通过体外细胞来研究miR-32对乳腺癌MCF-7细胞多种生物学行为的影响,通过高通量的表达谱基因芯片,结合生物信息学预测软件寻找miR-32的下游靶基因,研究目的是为了阐明其在乳腺癌发挥作用的分子机理。本课题的研究成果将加深对乳腺癌发病机制的了解,为乳腺癌的早期诊断及治疗提供新的线索,同时可以为与此相关的新药开发提供重要的分子靶点。首先以乳腺癌患者及癌旁组织患者的miRNA表达谱数据(GSE45666：101例乳腺癌组织,15例癌旁正常组织)为研究材料,导入Qlucore Omics Explorer软件进行分析,其中包括I期有23例,II期有44例,III期有29例,IV有3例,分期未知的2例,乳腺癌旁正常组织NA有15例。表达谱芯片分析结果显示与乳腺癌组织相比,miR-32在癌旁正常组织15例中是低表达。进一步进行临床乳腺癌组织样品及细胞系中的鉴定,收集临床27例乳腺癌组织、配对癌旁正常组织及MCF-10A、MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231细胞株。用Trizol试剂从细胞和肿瘤组织中提取总RNA,茎环RT-PCR方法进行miR-32的检测,U6作为内参,在ABI 7500上完成。分析结果得出：27例新鲜组织标本的检测发现,miR-32在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织,与生物信息学软件分析结果一致。人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比,miR-32在MCF-7细胞中的表达水平最高。因此我们选定MCF-7细胞作为体外细胞实验所用细胞株。其次,进一步对miR-32进行功能学研究。用miR-32 mimic、miR-32 inhibitor及对照组NC转染乳腺癌MCF-7细胞株,观察转染之后的细胞增殖、凋亡、周期、及迁移能力。分析结果得出以下结论：(1) miR-32 mimic成功转染了MCF-7细胞,转染之后,MCF-7细胞中miR-32的表达明显升高。miR-32 inhibitor成功转染至MCF-7细胞,转染后与对照组相比,MCF-7细胞中miR-32的表达明显降低。(2)MTT法检测细胞增殖情况,与阴性对照mimic NC相比,独立样本t检验分析转染miR-32 mimic细胞增殖,24h T=2.29,P=0.084；48h T=5.098,P=0.007；72h T=7.557,P=0.002；96h T=I 1.226,P=0.000；48h后P值均<0.05。与阴性对照inhibitor NC相比,独立样本t检验分析转染miR-32 inhibitor细胞增殖,24h T=-2.155,P=0.097；48h T=-9.651,P=0.001；72h T=-5.189,P=0.007；96h T=-4.849,P=0.008；48h后P值均<0.05。实验结果表明miR-32表达水平上调会促进MCF-7细胞的增殖, miR-32表达水平下调抑制MCF-7细胞的增殖。(3)流式细胞术检测细胞凋亡实验,与阴性对照mimic NC相比,独立样本t检验分析转染miR-32 mimic后细胞凋亡,早期凋亡T=-9.545,P=0.001；晚期凋亡T=-3.712,P=0.021；P值均<0.05。与阴性对照inhibitor NC相比,独立样本t检验分析转染]miR-32 inhibitor后细胞凋亡,早期凋亡T=9.307,P=0.001；晚期凋亡T=2.939,P=0.042-P值均<0.05。实验结果表明转染miR-32 mimic使miR-32表达上调抑制MCF-7细胞凋亡；转染miR-32 inhibitor后使miR-32的表达下调促进MCF-7细胞凋亡。(4)流式细胞术检测细胞周期检测,分别转染miR-32 mimic/inhibitor至乳腺癌细胞MCF-7,转染了miR-32 mimic的细胞在G1期、G2期、S期比例分别为55.92±0.88、10.28±0.49、33.61±0.95；mimic NC组在G1期、G2期、S期比例分别为53.49±0.28、13.38±2.35、33.06±2.20。另一组转染的]miR-32 inhibitor细胞在G1期、G2期、S期比例分别为62.04±0.64、10.4±2.47、27.51±1.86; inhibitorNC组在G1期、G2期、S期比例分别为64.26±1.57、4.65±1.03、31.09±2.56。根据独立样本t检验,P>0.05,实验结果表明上调或下调miR-32的表达在G1、G2、S期无统计学差异。miR-32表达上调或下调周期并未受到影响。(5)细胞划痕实验结果显示,经过36h无血清培养后,与阴性对照mimicNC相比,转染miR-32 mimic组的划痕距离明显减少,阴性对照mimic NC组还可见明显划痕,测量划痕距离并进行独立样本t检验统计分析,转染miR-32mimic组与mimic NC组对照相比,Oh T=0.174,P=0.867；36h T=-7.833,P=0.000,P<0.05具有统计学意义。转染1niR-32 inhibitor组与inhibitor NC组对照相比,0h T=-0.354,P=0.732;36h T=6.714,P=0.000,P<0.05具有统计学意义。实验结果表明miR-32表达水平上调促进MCF-7细胞迁移；miR-32表达水平下调抑制MCF-7细胞迁移。再次,对于乳腺癌中miR-32的靶点进行下一步研究,通过转染miR-32mimic及其对照组mimic NC后,采用表达谱生物芯片初步筛选,结果显示在mimic VS NC中,表达下调的mRNA中,参与泛素蛋白降解途径的有10个,其中E3泛素连接酶FBXW7下调3.1倍。根据KEGG通路进行分析得出在F-box中包括E3泛素连接酶FBXW7。结合多个生物信息学预测软件预测与E3泛素连接酶相关miR-32的靶基因,相关预测软件包括TargetScan、miRanda、PicTar、 miRBase、DIANA TarBase,生物信息学软件预测miR-32的靶基因与E3泛素酶相关的有HECW1和FBXW7。与基因芯片结果取交集(表达谱芯片探针未包括HECW1基因),表明靶基因可能是E3泛素连接酶HECW1和FBXW7。本课题拟以miR-32对HECW1和FBXW7为研究对象,研究miR-32在乳腺癌中的靶向调控及靶基因的功能。1)以MCF-10A细胞总RNA为模板,扩增基因HECW1 mRNA 3’UTR序列和基因FBXW7 mRNA 3’UTR序列,与psiCHECKTM-2 vector载体连接,构建重组质粒psiCHECKTM-2-HECW1-3’UTR、psiCHECKTM-2-FBXW7-3’UTR。2)以重组质粒psiCHECKTM-2-HECW1-3’UTR、 psiCHECKTM-2-FBXW7-3’UTR为模板,进行亚克隆。采用SOE的方法,扩增HECW1-3’UTR中miR-32结合位点种子序列分别突变的序列,扩增FBXW7-3’UTR中miR-32结合位点的种子序列突变的序列,构建重组质粒psiCHECKTM-2-HECW1-3’UTR-Mutant、psiCHECKTM-2-FBXW7-3’UTR-Mutant。31采用双荧光素酶报告基因检测系统对靶基因的确认。设立miR-32 mimic组、mimic NC组、miR-32 mimic mutant组和mimic NC mutant组进行实验,于293T细胞中进行转染,48h后检测各组荧光值,结果用统计学软件SPSS13.0的One Way ANOVA进行分析。4)统计分析结果表明miR-32 mimic+HECW1和三个对照组间均不存在显著性差异(P>0.05),即miR-32 mimic没有降低荧光值,四组间无显著性差异(P>0.05),表明miR-32的靶基因不包括HECW1; miR-32 mimic+FBXW7和三个对照组间均存在显著性差异(P<0.05),即miR-32 mimic降低了荧光值,而其余三个对照组间无显著性差异(P>0.05),表明miR-32的靶基因包括FBXW7。应用Western-blot的方法检测miR-32 mimic转染后的MCF-7细胞中FBXW7的表达,在乳腺癌MCF-7细胞中过表达miR-32后检测到FBXW7的蛋白水平均显著降低。证实miR-32对FBXW7具有负调控作用。确定了FBXW7为miR-32的靶基因,进一步检测miR-32与FBXW7的关系,在乳腺癌的临床组织样本中通过实时荧光定量PCR检测了FBXW7的mRNA表达水平,发现在所检测的27例配对的临床样本中,与配对的癌旁正常组织相比,有18例样本中FBXW7表达水平是低表达的,这与miR-32在这几例乳腺癌组织样本中表达升高呈现负相关性。采用了siRNA的方法抑制了FBXW7在MCF-7细胞中的表达,并通过实时荧光定量PCR检测,FBXW7表达明显下降,通过进一步实验验证FBXW7表达下调后对细胞生物学功能影响,如：细胞活力、凋亡、迁移形成情况的影响。根据实验结果本章得出以下结论：利用siRNA方法成功的抑制了FBXW7在MCF-7细胞中的表达。MTT实验并通过独立样本t检验,MCF-7细胞在转染FBXW7 siRNA 48h后,与对照组siRNANC对比,T=4.298,P=0.013,有统计学意义,说明FBXW7表达下调促进MCF-7细胞增殖。细胞凋亡实验表明,转染FBXW7 siRNA后,早期凋亡T=-13.253,P=0.000-晚期凋亡T=-5.631,P=0.028； P值均<0.05,FBXW7表达下调会抑制MCF-7细胞的凋亡。细胞划痕实验结果表明,与阴性对照组siRNA NC相比,0h T=0.25,P=0.809;36h T=-6.393,P=0.000,FBXW7表达下调会促进MCF-7细胞的迁移。综上所述,本课题通过生物信息学分析,并在乳腺癌临床病例及体外细胞系中确定miR-32的表达,通过表达谱基因芯片及生物信息学预测,采用双荧光素酶报告基因检测系统初步确认了miR-32的靶基因为E3泛素连接酶FBXW7。在乳腺癌MCF-7细胞中进行了过表达和抑制表达研究,阐明了miR-32在乳腺癌中的功能,并证明了miR-32的靶基因包括E3泛素连接酶FBXW7。并在MCF-7中下调FBXW7的表达,反向验证其生物学实验功能。为乳腺癌的治疗提供了一个潜在靶点。结果也表明miR-32在乳腺癌中高表达且起到肿瘤促进作用,推测miR-32的高表达和乳腺癌的发生机制有关,具体机制尚需进一步的研究。