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研究背景肌萎缩脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一种侵犯上下运动神经元的神经系统慢性变性疾病。它是以进行性的肌无力为特点的致死性疾病,大多数患者在病发的3-5年内死于呼吸衰竭。40-70岁的人是渐冻症的高危人群。在ALS的病因学以及发病机制中,重视胶质细胞及神经炎症的作用或可视为认识这种顽症关键,近几年来研究证据表明,小胶质细胞激活并诱发运动控制区的神经细胞发生过度的炎症反应极大地影响着ALS的发生、发展与恶化。小胶质细胞是一种广泛分布于中枢神经系统的具有免疫以及炎症功能的胶质细胞,大约占胶质细胞的20%,脑内细胞的10%,是目前公认的对脑损伤和神经退行性疾病进行性反应的中枢神经系统效应细胞。因此,针对神经细胞的炎症反应研究及研发新药,是目前热点课题。但迄今为止,美国FDA批准了一种治疗ALS的药物——力鲁唑(Riluzole),遗憾的是它不是一种有效的治疗ALS理想药物,它仅能延长患者几个月的生命,不能逆转疾病进行性恶化的发生。因此研发毒副作用小而有效地治疗ALS的药物具有重要理论和实际意义。羧胺三唑(carboxyamidotriazole, CAI)是本实验室一直研究的个小分子化合物,它是一种能够抑制细胞内钙外流,同时在多种急性、亚急性和慢性炎症中具有显著的抗炎作用。为考察该药物对ALS潜在的治疗作用,我们通过以LPS活化的小鼠神经小胶质细胞(microglial cell,BV2)的体外模型和ALS转基因鼠(hmSOD1-G93A)的体内模型观察药物CAI对ALS的影响,并从细胞水平和分子水平探讨CAI对ALS体内和体外模型的保护作用,为探索CAI在ALS疾病的防治中的潜在效能提供理论依据。研究方法采用以脂多糖(LPS)活化的小鼠神经小胶质细胞(microglial cell,BV2)为体外模型,设计给CAI组(10、20、30和40μmol/L)、溶剂对照组(DMSO)、空白对照组(control,无LPS)。采用CCK-8法(Cell Counting Kit-8)测定药物CAI对BV2细胞增殖与存活的影响,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定BV2细胞培养上清中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-a、白介素(interleukin, IL)-1βIL-6,干扰素(interferon, IFN)-y水平,采用硝酸还原法(Griess)测定经LPS活化的BV2细胞培养上清中一氧化氮(NO)的含量。采用荧光定量PCR (Real-Time and Quantitative PCR)测定BV2细胞中TNF-a,IL-1β,诱导性一氧化氮合酶(iNOS)、环氧化酶-2(COX-2)的mRNA的表达水平。采用SOD1转基因小鼠为体外动物模型,设计给CAI组(20mg/Kg)和对照组(聚乙二醇PEG-400),观察小鼠的体重变化以及生存期的变化,每周进行两次Roto-Rod转杆试验观测小鼠运动耐力的改变,观察小鼠有无后肢萎缩,跛行,运动的影响等情况,动物死亡时间：小鼠30s内不能从仰卧位翻身为俯卧位即可认定为死亡。研究结果1.CCK-8法测定经LPS刺激后的BV2细胞,给药物CAI组(剂量为：5、10、20、30和40μmol/L)与溶剂对照组和空白对照组相比,结果显示细胞的增殖与存活没有明显改变,研究结果表明不同浓度的CAI对BV2细胞的增殖与存活没有影响,CAI对于BV2细胞中炎性介质的影响不是基于其对BV2细胞增殖和存活的改变而产生的,而可能是通过对其它细胞信号通路的影响而发生效应的。2.与对照DMSO组相比,不同浓度CAI (10-40μmol/L)对经LPS刺激后的BV2细胞中TNF-αIL-1β、IL-6分泌都有明显的剂量依赖性抑制作用,CAI浓度在20、30、40μmol/L时能够剂量依赖性抑制BV2细胞TNF-a的分泌其结果分别为：(359.4±12.9 vs 241.6±16.1*’135.7±6.4**’5.3±1.9**pg/ml,p<0.01),同时也可显著抑制IL-1β、IL-6的分泌(p<0.01)。3.与对照DMSO组相比,不同浓度CAI (10-40μmol/L)对经LPS刺激后的BV2细胞中TNF-αIL-1,βiNOS, COX-2等因子的mRNA的表达水平有明显的剂量依赖性抑制作用,CAI浓度在20、30、40μmol/L时能够剂量依赖性抑制BV2细胞TNF-a mRNA的表达水平其结果分别为：(102.30±7.954vs 15.271±1.677**,5.800±1.032**,9.379±2.027**,p<0.01),也可显著抑制IL-1βCOX-2、iNOS的mRNA的表达水平(p<0.01)4.与对照DMSO组相比,不同浓度CAI (10-40μmol/L)对经LPS刺激后的BV2细胞中NO的分泌有明显的剂量依赖性抑制作用,CAI浓度在20、30、40μmol/L时能够剂量依赖性抑制BV2细胞NO的分泌其结果分别为：(77.67±2.36vs22.67±5.77**,17.67±2.36**,3.78±5.09**, p<0.01)5.与对照DMSO组相比,药物CAI组(20mg/kg) SOD1转基因小鼠的运动耐力得到一定程度的改善,体重降与对照组相比有所缓解,但对SOD1转基因小鼠发病时间及生存期未见明显作用。结论CAI能够明显降低在ALS的BV2细胞模型中炎性介质TNF-α.IL-1β.NO.IL-6的分泌以及TNF-a、IL-1β、COX-2和iNOS等因子的mRNA的表达,对小胶质细胞的活化及其炎性反应有明显的抑制作用,上述作用呈现出剂量依赖关系。CAI能够在一定程度上改善SOD1转基因模型鼠的运动耐力,在转杆实验中CAI组在SOD1转基因模型鼠动物日均龄106d后的表现与对照组比有所改善；同时CAI组对实验动物的体重降低情况也有一定程度缓解,但是CAI组和DMSO组SOD1转基因模型动物对动物发病时间和生存期都未见明显的作用。初步的研究结果可以推测,CAI作为一种口服的小分子化合物药物,对ALS疾病的作用深入研究具有一定的潜在应用价值。