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鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)是近年来新发现的水禽感染性病原,造成鸭生长迟缓,体重下降等症状。病毒主要侵染鸭淋巴器官,患鸭后会引发免疫抑制及可能的二次感染,对养殖业造成了较大的经济损失。因此,分析我国DuCV的遗传演化规律并构建体外转录的模型具有十分重要的科学意义。1.DuCV的分离、鉴定及全基因组序列分析本研究从疑似感染DuCV的病鸭体内分离到一株DuCV(命名为DuCV-GH01),通过PCR得到病毒全基因组进行序列分析表明,DuCV-GH01的核苷酸序列与目前GenBank登录的所有DuCV序列相似性高达81.8%～99.4%,根据PASC的p值/频率分布图获得,当不同基因组的p值大于0.170时,可分为DuCV1和DuCV2;当DuCVl和DuCV2的型间p值大于0.032或0.018时,可以将鸭圆环病毒细分为1a、1b、1c和2a、2b、2c 6个亚型。这个结果证明DuCV由一个共同祖先经过不同的进化过程分化为DuCV-1和DuCV-2。2. DuCV的基因重组及选择压力分析通过系统进化树分析发现利用全基因组进行分型时的3株DuCV-2a毒株(GenBank No.EU344802.EU344805和EU499309)在利用Rep基因进行基因分型时结果不同。通过分析发现,是由于这3株毒株的Rep基因的第71至581位碱基序列与DuCV-1a的相同区域的碱基序列发生了重组。利用基因重组分析软件获得DuCV的5个主要基因重组事件,且重组主要发生非结构蛋白Rep和结构蛋白Cap的编码区,DuCV利用基因重组增加其基因组的多样性。通过对DuCV1型和2型的抗原表位以及糖基化位点分析,表明DuCV1型和DuCV2型的氨基酸的差异,可能造成DuCV1型的抗原性稍强于DuCV2型的抗原性,使其所受到的免疫压力更大。此外,经分析选择压力中的净化选择压也在DuCV的进化中起到了重要的作用。3. DuCV反向遗传学平台的建立及其病毒拯救为了构建含有遗传标记的感染性克隆,进一步研究鸭圆环病毒的致病机制。本研究利用PCR扩增鸭圆环病毒GH01株全基因组CG,将2个基因组Ic-1、IC-2顺式连接插入到pUC19载体中获得串连双拷贝重组质粒pIC-2DuCV,并通过同义突变引入酶切标记位点Xho1获得pIC-Mu2DuCV。重组质粒pIC-Mu2DuCV经过EcoRI线性化,以1OOμg/kgDNA和200μl/kg的脂质体肌肉注射10日龄DuCV阴性雏鸭。结果显示,成功构建含有分子标记XhoI的串连双拷贝重组质粒pIC-Mu2DuCV,经肌肉注射雏鸭转染组于转染21d后检出血清阳性,并通过测序经XhoI标记位点将拯救出的病毒与野生毒株进行区分。本试验构建的DuCV全长基因组头尾串联二聚体感染性克隆DNA可以转染雏鸭并增殖出带标记的DuCV病毒,为进一步研究DuCV分子特性和致病机理打下了基础。4.拯救毒株的部分生物学特性研究采用本文构建的感染性克隆技术构建对鸭圆环病毒GH01株进行病毒拯救,拯救出病毒(命名为PMDC),与亲本毒株GH01进行增殖与致病性分析。对照组PBS组的平均日增重(ADWG)明显高于拯救毒株PMDC、亲本毒株GH0l感染组,统计学差异显著(p<0.05),而PMDC组的ADWG低于GH01组,但统计学差异不显著(p>0.05)；直肠温度监测表明,各实验组感染雏鸭均无任何体温表现,其直肠温度均在41.7℃-42.2℃之间；PMDC、GH01、PBS组的临床评价分别为12.6、15.6和0,说明PMDC组和GH01组无明显差异,且同时都与阴性对照PBS组差异显著；病毒血检测发现,PBS组无病毒血症出现,GH01、PMDC组分别于攻毒后10d和15d检测到病毒血的出现；同时,GH01、PMDC组分别于15d和21d开始出现DuCV特异性抗体。经过定量检测,血清中含量最低,病毒载量在2.75 x 103-7.06×103copies/μL之间,但出现较早,分别于10DPC和15DPC就在GH01组和PMDC组中检测到。在GH01组中法氏囊于10DPC首次检测到DuCV,病毒载量为8.73×103-4.39×104 copies/mg,PMDC组于15DPC时在BF中检测到病毒核酸,其载量为4.72×1O3-8.34×1O3 copies/mg。本研究证明,拯救的毒株PMDC与亲本毒株GH01的致病性和增值能力相似,但均低于亲本毒株。