脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）是十分常见脊柱外科疾病。脊髓损伤分为两个阶段:原发性损伤和继发性损伤。在原发性损伤结束后的数小时至数月内持续破坏的继发性损伤是进一步导致神经系统创伤后功能减退的重要元凶。在继发性损伤过程中,持续的活性氧/氮类物质产生及其导致的线粒体功能紊乱、DNA的损伤,这些事件被认为是细胞死亡信号通路中的关键事件。聚（ADP-核糖）聚合酶-1（PARP-1）,一种DNA缺口传感器酶,介导细胞内DNA损伤的检测和修复,是响应活性氧/氮类物质诱导的DNA损伤,尤其是单链DNA断裂的主要分子。正常情况下,PARP-1是由DNA损伤激活并促进DNA修复的核酶。聚（ADP-核糖基）化响应轻微的氧化性损伤,影响DNA修复,作为内环境稳定机制之一,但是,在持续的氧化应激暴露下,它会成为促细胞死亡因素。2007年,约翰霍普金斯大学医学院Dawson工作室发现并命名了一种新的程序性脑细胞死亡形式,即聚（ADP-核糖）聚合酶-1（PARP-1）的过度活化引起内在的半胱氨酸蛋白酶非依赖性细胞死亡程序,称为parthanatos,术语细胞死亡命名委员会在2012年也正式确定了这种PARP依赖的细胞死亡途径,报道其广泛涉及许多疾病,包括帕金森氏病,心脏病发作,缺血再灌注损伤,脊髓损伤,与缺血性和缺氧性脑损伤。在这一过程中,细胞凋亡诱导因子（Apoptosis-inducing factor,AIF）是介导PARP-1依赖性细胞死亡的关键因子。凋亡诱导因子促进细胞死亡的机制中一个关键事件是PARP-1激活后,凋亡诱导因子迅速响应细胞死亡信号,从线粒体移位至细胞核,在细胞核中诱导染色质浓缩和导致细胞死亡的大规模DNA片段化。我们知道,由于与脊髓损伤病理相关的氧化损伤,parthanatos与DNA损伤高度相关。然而,直到2016年发现了巨噬细胞迁移抑制因子的核酸酶活性后,凋亡诱导因子介导DNA碎片化的机制才得以阐明。先前的研究集中在减少PARP-1的过度活化,凋亡诱导因子的核易位以及抑制parthanatos的PAR聚合物的形成。然而,PARP-1同时具有DNA损伤检测和修复的生理功能功能。而凋亡诱导因子则被证明是线粒体呼吸和功能维持所必需的,敲除后可能会引起神经变性和神经系统发育异常。因此,抑制PARP-1和凋亡诱导因子可能在急性和慢性中枢神经系统损伤中均具有内在风险,巨噬细胞迁移抑制因子干预的有效性值得进一步验证,以期挖掘出与PARP-1和凋亡诱导因子类似的的新的能够抑制parthanatos进程的治疗靶点。另一方面,此前研究认为,许多与神经元对氧化应激作出反应有关的研究都是基于与体内脊髓损伤氧化剂水平无关的培养细胞的使用。根据一项使用大鼠动态监测脊髓损伤后观察到的氧化应激水平的研究,暴露于150μM H2O2与脊髓损伤后观察到的椎管内氧化应激状况密切相关。值得注意的是,据报道该浓度是亚致死的,短期治疗可导致生长停滞或细胞衰老,长期治疗可诱导细胞凋亡或单性结瘤。然而,较早的研究表明,不同类型的细胞对H2O2诱导的氧化应激具有不同的耐受性和反应,而增加的氧化应激可导致caspase-3抑制和持久性PARP-1活化并导致parthanatos。因此,在不同细胞类型中,导致细胞凋亡或parthanatos的氧化应激之间的区别是有争议的。目的:本研究主要目的是探究神经细胞在模拟脊髓损伤后椎管内水平氧化应激（基于一项使用大鼠动态监测脊髓损伤后观察到的氧化应激水平的研究,暴露于150μM H2O2与脊髓损伤后观察到的椎管内氧化应激状况近似）时,对巨噬细胞迁移抑制因子进行敲减能否减少神经细胞parthanatos死亡进程。研究方法:根据既往研究发现,该浓度（150μM H2O2）诱导的氧化应激在某些细胞中是亚致死的,根据暴露时间不同,报告的细胞结局包括细胞生长停滞,细胞衰老,细胞凋亡和parthanatos。此外,研究还表明,不同类型的细胞对H2O2诱导的氧化应激具有不同的耐受性和反应。因此,首先需要确定长时间暴露于150μM H2O2的神经元的结局,即这一水平氧化应激对神经元而言是否为致死性浓度。我们在此水平氧化应激处理后,使用流式细胞术（annexin-V/PI）检测不同浓度组细胞死亡情况。若验证为致死性浓度后,由于胞凋亡与细胞parthanatos二者关系密切,因此,细胞在面对不良刺激时最终究竟做出促凋亡或促parthanatso的决定将取决于多种因素,则需要进一步探明细胞死亡途径,即通过细胞凋亡还是parthanatos。在此步骤,我们使用了依托泊苷（etoposide,ETO）诱导经典细胞凋亡（ETO组）与氧化应激组（H2O2组）进行对比,同时使用PARP-1抑制剂PJ-34和广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK分别对两种处理组进行干预。通过使用流式细胞术（annexin-V/PI）检测细胞死亡量以及annexin-V/PI细胞信号分布,使用免疫荧光检测细胞核内PARP-1激活产物多聚PAR链荧光信号来验证两组差别;再使用蛋白印迹检测（western blot）分别检测两组中经典凋亡途径中PARP-1和caspase-3的剪切体情况;再使用免疫荧光共定位检测对parthanatos进程中PARP-1激活后的下游途径中的核心分子（即凋亡诱导因子和巨噬细胞迁移抑制因子）细胞内空间变化情况以及使用蛋白印迹检测凋亡诱导因子细胞随氧化应激暴露时间向核内转移情况。在证实此水平氧化应激暴露导致parthanatos后,对通过腺病毒转染对细胞中巨噬细胞迁移抑制因子进行敲减后重新暴露于相同水平氧化应激下,分别进行免疫荧光共定位检测验证凋亡诱导因子和巨噬细胞迁移抑制因子细胞内空间变化情况;使用流式细胞术（annexin-V/PI）检测细胞死亡变化情况;再通过碱性彗星检测和中性彗星检测观察巨噬细胞迁移抑制因子敲减对DNA链断裂情况影响。结果:首先,浓度梯度H2O2处理后流式细胞术（annexin-V/PI）检测结果表明150μM H2O2为致死性浓度（annexin-V/PI双阳性细胞67.5%）。其次,H2O2处理后annexin-V/PI双阳性细胞为62.5%,能够被PJ-34阻断,而Z-VAD-FMK无效;依托泊苷组annexin-V阳性/PI阴性（+/-）细胞为30.7%,能被Z-VAD-FMK阻断,而PJ-34无效。此外,依托泊苷组核内未出现强烈多聚PAR链荧光信号而H2O2组核内出现强烈荧光信号且能够被PJ-34阻断。而依托泊苷组蛋白印迹出现典型凋亡PARP-1和caspas-3剪切体,而H2O2暴露组未出现,同时H2O2组还观察到明显的细胞核内凋亡诱导因子和巨噬细胞迁移抑制因子荧光信号,依托泊苷组未出现。巨噬细胞迁移抑制因子敲减后再次暴露H2O2,细胞死亡量显著减少（13.6%,对照组61.5%,空白组57.8%）;中性彗星实验和碱性彗星实验结果显示,DNA单/双链断裂情况均显著减少;免疫荧光共定位结果还显示凋亡诱导因子敲除后,巨噬细胞迁移抑制因子核内转移显著减少,表明巨噬细胞迁移抑制因子核募集是凋亡诱导因子依赖性的。结论:本研究是首次1)采用了基于一项大鼠脊髓损伤造模后椎管内氧化应激水平动态监测的结果设定施加的氧化应激水平（150μM H2O2）;2)并验证了这一氧化应激浓度在神经细胞中为致死性浓度;3)确定了这一水平氧化应激对神经细胞造成的死亡是parthanatos而非凋亡;4)验证了巨噬细胞迁移抑制因子敲减能够减轻氧化损伤后的神经细胞parthanatos。证实了巨噬细胞迁移抑制因子干预的效果,巨噬细胞迁移抑制因子有望成为脊髓损伤,乃至多种急慢性中枢神经系统损伤的治疗中十分有潜力的干预靶点。