探索肿瘤检测新方法和新工具,对于实现肿瘤早期诊断进而改善患者治愈率和生存率具有重要意义。核酸适配体（Aptamer）作为一种人工合成的“化学抗体”,能够特异性的识别肿瘤相关标志物和肿瘤细胞,具有亲和力强、靶向性好、合成简便、性质稳定等一系列优点,目前已被认可为新一代的分子识别探针,在肿瘤相关基础研究中得到广泛应用并展现出重要价值。一般而言,完整的肿瘤细胞靶向性Aptamer包含较长的核苷酸序列（通常为30到100个碱基）,这不仅增加了合成难度,使其二级结构趋于复杂化,同时也不利于靶响应性激活式Aptamer探针的再设计。相比之下,裂开型Aptamer探针结构通过将完整Aptamer进行理性断裂成两个或多个核苷酸短片段,不但设计灵活、制备简单、价格经济,而且能够在保留Aptamer靶向识别性能的同时,衍生出独特的新特性（如温度敏感性）,有望大大提升Aptamer在肿瘤分析领域的应用空间。然而,肿瘤特异性裂开型Aptamer相关研究仍处于起步阶段,已开发的探针数目极少,并存在功能性不强、亲和力不足、灵敏度有限以及信号转换模式单一等一些关键性问题亟待解决。基于此,本论文针对上述各关键性问题,以发展肿瘤细胞分析新方法为目标,构建了一系列具有靶驱动自组装性能的裂开型Aptamer探针,并通过引入聚合酶链式反应（PCR）、滚环放大技术（RCA）、杂交链式反应（HCR）和链置换效应等多种信号转换和放大机制,选择人肝癌细胞、人白血病淋巴细胞为研究对象,系统开展了肿瘤细胞的高灵敏检测、可控操纵、实时分析及活体成像研究。具体工作如下:一、温度响应性裂开型Aptamer结合PCR技术用于肿瘤细胞的免标记和高灵敏检测研究基于Aptamer的PCR技术（Apta-PCR）在肿瘤细胞检测领域具有快速、灵敏等优点,然而现今报道的Apta-PCR方法一般需要破坏细胞以获得Aptamer片段以进行PCR放大,不利于细胞的后续分析研究,或者需要对Aptamer进行特殊修饰,成本昂贵。为了克服这些缺陷,本工作利用裂开型Aptamer高效靶向细胞的能力及其温度敏感的性质,可特异性识别靶肿瘤细胞并通过简单温和的调控方式获得Aptamer片段,结合PCR技术,建立了一种免标记高灵敏检测肿瘤细胞的新方法。首先通过将PCR引物链连接在一条裂开型Aptamer片段split apt-a上,结合另一裂开型Aptamer片段split apt-b,成功设计了一种具有SMMC-7721人肝癌细胞特异性靶向能力以及PCR扩增特性的裂开型Aptamer。与细胞孵育后,通过将温度升高至37 ℃使得Aptamer片段脱离细胞表面,分离出split apt-a探针,采用PCR技术进行扩增,经过SYBR Green I染色后进行荧光分析,实现SMMC-7721肿瘤细胞的简便、免标记和高灵敏检测,可在2000μL溶液中检测到100个细胞。该方法也可用于靶向CCRF-CEM细胞的裂开型Aptamer设计,具有一定的通用性。同时,此方法获取Aptamer片段的手段温和,对细胞表面蛋白活性及细胞活力无不良影响,有利于可能的后续分析研究。采用DNA内嵌染料实现荧光信号的获得,克服了 DNA标记步骤繁琐、成本昂贵等缺陷,且不需要对Aptamer进行多余的修饰,避免了染料分子对Aptamer识别能力的影响,从而有效降低了肿瘤细胞检测成本、简化了实验准备步骤,为Aptamer分子探针用于肿瘤细胞检测提供了一种新的思路方向。二、靶驱动裂开型Aptamer自组装结合邻近诱导HCR反应用于肿瘤细胞的高灵敏检测研究为了实现肿瘤细胞直接检测及简单、无酶信号放大转换的目的,利用HCR技术操作简单、设计灵活、信号放大能力强的特点,结合裂开型Aptamer特异性靶向肿瘤细胞并在其细胞表面进行聚集组装的特性,构建了一种裂开型Aptamer聚集诱导的HCR技术用于肿瘤细胞的高灵敏检测。该策略通过在细胞表面实现DNA分子的自组装及信号放大,进一步实现了肿瘤细胞的定量检测。首先设计了包含裂开型Aptamer序列及裂开型HCR触发链序列的裂开型HCR探针对,即split HCR-a和split HCR-b。该裂开型Aptamer探针对能够在靶细胞表面发生特异性的聚集组装,使得两条裂开的HCR触发序列靠近形成完整的触发序列,从而打开H1发夹链,触发HCR反应,产生大量的荧光信号,进而实现肿瘤细胞的高灵敏检测,结合缓冲液中最低可检测到20个细胞。同时,该探针能够实现混合细胞体系中SMMC-7721的识别分析检测,并且能够在含有10%血清的细胞样中实现SMMC-7721的定量检测。该探针利用裂开型Aptamer和HCR技术,实现了细胞表面的组装及信号放大,具备高特异性及高灵敏度,大大推动了 Aptamer分子探针在肿瘤检测领域的应用进程,有望作为一种新型的技术手段用于高灵敏度和高选择性检测肿瘤细胞。三、裂开型Aptamer结合RCA技术用于温度响应性DNA纳米聚合物的构建及肿瘤细胞的检测与操控研究为了解决现今单体Aptamer探针亲和力不足、功能性单一等缺陷,利用RCA技术结合温度敏感的裂开Aptamer构建了一种纳米复合体用于肿瘤细胞的高灵敏检测、捕获及释放。首先通过RCA技术构建一条包含众多split-b及poly T序列的DNA长链（命名为nanosolo）,该nanosolo结构因含有split-b序列的重复单元,结合split-a片段,以多价识别的方式在细胞表面自组装成DNA组装体结构（命名为nanoensemble）,从而实现靶肿瘤细胞快速、特异性检测及捕获,进一步升高温度至37 ℃,可释放捕获的细胞。相比于单体裂开型ZY11 Aptamer探针,该nanoensemble探针具有更强的亲和力,其检测信背比提高了 2.8倍。与此同时,该nanoensemble探针具有更加广泛的适用温度,能够在4 ℃到室温之间实现细胞的靶向检测。此外,该nanoensemble探针表现出了高特异性及稳定性,能够实现血清及混合细胞样中SMMC-7721细胞的分析检测。该探针不但大大改善了单体裂开型Aptamer亲和力低、灵敏度不高、适用温度范围窄的缺陷,而且引入了 DNA纳米材料,能够作为一种有效的药物载体用于肿瘤细胞的治疗研究。总之,作为一种DNA纳米材料构建的多功能的智能型Aptamer分子探针,该nanoensemble探针在肿瘤的诊断及治疗领域有着极大的应用潜力。四、激活式裂开型Aptamer探针结合DNA链置换技术用于肿瘤细胞的实时快速检测和活体成像研究在生理条件下实现肿瘤细胞的检测及实时分析对肿瘤疾病研究具有重要的意义。为了解决现今裂开型Aptamer探针不能有效用于生理条件下肿瘤细胞检测以及相关信号转化速率较慢的问题,利用DNA链置换反应速度快、信号转化灵敏的特性,结合理性设计的裂开型Aptamer构建了一种基于细胞表面的链置换的分子探针,成功实现了靶肿瘤细胞的实时检测及活体肿瘤荧光成像研究。选用了能够特异性靶向SMMC-7721肿瘤细胞的裂开型AptamerZY11a和ZY11b片段,并在两条探针的端部设计了裂开型触发序列,然后通过一段poly T序列将两条探针连接在一起,形成一条新的裂开型Aptamer探针,即split-ZY11-SD探针。该探针能够特异性识别靶细胞进而发生结构变化使得裂开型触发序列靠近形成完整触发序列,从而触发链置换反应,在生理条件下实现肿瘤细胞的快速、灵敏检测。流式分析结果表明,该split-ZY11-SD探针能够在1 min内实现SMMC-7721细胞的高灵敏检测,信背比可达15左右。采用激光共聚焦荧光显微镜,能够实现对SMMC-7721细胞的实时成像分析。而且,该探针能够对混合细胞体系中SMMC-7721细胞进行定量检测。血清中SMMC-7721细胞的分析检测结果显示,该探针具备良好的抗干扰能力。进一步将该探针注射至小鼠肿瘤部位,可实现SMMC-7721细胞的活体成像分析。该探针有望作为一种新型分子探针用于肿瘤细胞的实时检测及活体成像研究。