背景：　　 在世界范围内，脑卒中是死因排第二位的疾病，同时也是致残的主要原因。随着人口的老龄化，脑梗死的发病率还在不断地攀升。而缺血性卒中(脑梗死)约占脑卒中的80％，目前被证明有效的药物仅有溶栓药和抗血小板剂。溶栓治疗是目前最有效的治疗手段，但溶栓治疗的适应症非常严格而且具有潜在的风险(如颅内出血)导致仅有极少数病人能接受溶栓治疗。目前其它的治疗手段疗效还是差强人意。探索新的治疗方法是显得很有必要的。这需要全面地弄清缺血性脑组织损伤的复杂机制。　　 炎症反应是脑缺血再灌注后重要的病理生理过程，早期造成组织损伤，而后期可能还具有内源性修复作用。近年的研究发现，先天免疫系统的重要组成部分——Toll-1ike receptors(TLRs)介导了缺血性损伤，而对其中成员TLR9作用的研究才刚刚起步。TLR9在中枢神经系统的神经元细胞和小胶质细胞都有表达。并且拥有两条不同的信号传导通路，分别经过NFκB或IRF7途径，诱导促炎因子(TNF-α，IL-1)或神经保护分子(IFN-β，IFN-α)的产生。这两条通路在脑缺血后不同阶段如何发挥作用还不清楚。弄清TLR9信号通路在脑缺血损伤与修复中的作用以及TLR9信号通路下游传导的具体机制，将有助于加深对TLRs所介导的缺血性损伤的了解，并有可能为脑梗死不同阶段的治疗提供多个新的靶点。　　 研究目的：　　 观察脑缺血再灌注早期缺血脑组织TLR9信号的激活情况，弄清脑梗死早期两条TLR9信号通路的被激活是否不同。　　 研究方法：　　 1.实验动物　　 健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠120只，清洁级，体重280-330g。人工昼夜节律饲养。　　 2.缺血再灌注模型的制作　　 参照Longa氏方法，并加以改良。缺血时间为1.5小时，到缺血时间后，将栓线拉回颈外动脉主干中，从而实现再灌注。对照组不插线，其余操作同上。　　 3.实验分组　　 (1)动物模型分组　　 1)6h组：1.5小时缺血再灌注，观察点为术后6h：50只。　　 2)3d组：1.5小时缺血再灌注，观察点为术后3天：50只。　　 3)6h-假手术组(Sham-operated group，6h)：10只。　　 4)3d-假手术组(Sham-operated group，3d)：10只。　　 (2)分子生物学实验分组　　 1)I1：1.5h IR MCAO模型，术后6h，缺血侧(右侧)；　　 2)I2：1.5h IR MCAO模型，术后3d，缺血侧(右侧)；　　 3)C1：1.5h IR MCAO模型，术后6h，缺血对侧；　　 4)C2：1.5h IR MCAO模型，术后3d，缺血对侧；　　 5)S1：假手术组，术后6h，右侧；　　 6)S2：假手术组，术后3d，右侧；　　 4.TTC染色　　 取部分标本行该项染色，以确定梗死灶。取厚约1.5mm的冠状切面的脑组织(不固定)，加入2％TTC溶液约30ml，避光、37℃孵育30min。　　 5.RT-PCR　　 取大鼠的前囟冠状面的双侧额顶叶的大脑皮层，分别提取RNA，检测TLR9，TNF-α、IFN-β、IRF7的mRNA表达水平。　　 6.Western-Blot　　 取大鼠的前囟冠状面的双侧额顶叶的大脑皮层，分别提取蛋白，检测TLR9，TNF-a，IFN-B的蛋白表达水平。　　 7.图像分析　　 利用Quantity One(ver4.6.2)对所得的电泳图像作分析。比较目标条带与内参的光密度比值。　　 8.统计学分析　　 采用SPSS for Windows Ver.16.0统计软件对所得数据进行统计学处理。所有计量资料的比较采用t检验分析，结果用(x)±s表示，p＜0.05认为有统计学差异。　　 实验结果：　　 1.模型的成功率和死亡率　　 用于本实验共120只大鼠，其中对照组(6h、3d)各10只，术后无一死亡。1.5h IR MCAO模型成功率(术后出现瘫痪且开颅排除并发脑出血：图3)为82％。1.5hIR后6h组死亡率为17.5％，3d组为38.1％，由于失败率和死亡率，实际成功的MCAO大鼠模型为50只，其中1.5hIR-6h组有25只，1.5hIR-3d组有25只。　　 2.TTC染色　　 根据Longa氏法并加以改良的手术方法，1.5h IR后能成功诱导大鼠MCAO模型。术后大鼠出现明显的左上肢瘫痪、转圈、追尾征。TTC染色示缺血侧(右侧)大脑半球可见明显白色梗塞灶(图4)。I1组和I2组的梗死体积分别为126.6±11.14mm3和129.6±7.23m3，经统计学分析(t检验)，p为0.485，无明显差异。　　 3.RT-PCR结果　　 (1)从大鼠脑组织中提取总RNA，可见完整的285、18S、5S三条带(图5)。　　 (2)TLR9的mRNA的表达情况(图6)。　　 I1组的相对表达量为0.4334±0.0286，I2组为0.9326±0.0291。在缺血侧的表达随时间的延长而增高(p=0.000)，而在缺血对侧和对照组，TLR9 mRNA未检出。　　 (3)TNF-α的mRNA的表达情况(图7)。　　 I1组的相对表达量为1.2086±0.1006，I2组为2.2625±0.1611，C1组为0.4431±0.0385，C2组为0.4722±0.0422。TNF-αmRNA在缺血侧的表达随时间的延长而明显增高(p=0.000)，缺血对侧TNF-αmRNA的亦有表达，且缺血对侧的表达未随时间的延长而增加(p=0.451)。TNF-αmRNA在缺血侧表达比缺血对侧更高(p=0.000[I1 vs C1]，p=0.000[I2 vs C2]).对照组未见TNF-αmRNA表达。　　 (4)IRF7 mRNA表达情况(图8)。　　 I1组的相对表达量为0.4418±0.0386，I2组为1.2667±0.168，IRF7 mRNA在缺血侧的表达随时间的延长而明显上升(p=0.000)，在缺血对侧与对照组未见IRF7 mRNA的表达。　　 (5)IFN-β mRNA的表达情况(图9)。　　 I1组的相对表达量为0.1487±0.0209，I2组为0.2596±0.0336，IFN-βmRNA在缺血侧的表达随时间的延长而明显上升(p=0.009)，在缺血对侧与对照组未见IFN-β mRNA的表达。　　 (6)RT-PCR结果汇总分析　　 6h和3d两个时间点，缺血侧TNF-αmRNA的表达明显高于IFN-β mRNA的表达(p=0.000[6h]，p=0.000[3d])(见图10)。　　 4.Western-Blot结果　　 (1)TLR9蛋白的表达情况(图11&表2)。　　 TLR9蛋白在缺血侧的表达随时间的延长而明显增高(p=0.000).在相同的时间点，TLR9蛋白在缺血侧的表达明显高于缺血对侧(p=0.000[6h]，p=0.000[3d])。相同的时间点缺血对侧和对照组没有明显差别(p=0.519[6h]，p=0.515[3d])，缺血对侧以及对照组的表达没有随时间的变化而变化(p=0.913[C1 vsC2]，p=0.894[S1 vs S2])。　　 (2)TNF-α的蛋白表达情况(图12&表3)：TNF-α蛋白在缺血侧的表达随时间的延长而明显增高(p=0.042).在相同的时间点，TNF-α蛋白在缺血侧的表达明显高于缺血对侧(p=0.000[6h]，p=0.000[3d])。缺血对侧的表达明显高于对照组(p=0.003[6h]，p=0.000[3d])。缺血对侧和对照组的表达情况没有明显的随时间变化而变化(p=0.744[C1 vs C2]，p=0.696[S1 vs S2])。　　 (3)IFN-β的蛋白表达情况(图13&表4)：IFN-β蛋白在缺血侧的表达随时间的延长而明显增高(p=0.001).在相同的时间点，IFN-β蛋白在缺血侧的表达明显高于缺血对侧(p=0.004[6h]，p=0.000[3d])。缺血对侧的表达与对照组没有明显差别(p=0.449[6h]，p=0.608[3d])。缺血对侧和对照组的表达情况没有明显的随时间变化而变化(p=0.607[C1 vs C2]，p=0.089[S1 vs S2])。　　 (4)Western-blot蛋白分析结果汇总(图14)：在相同的时间点，缺血侧和缺血对侧TNF-α蛋白的表达明显高于IFN-β(p=0.003[6h]，p=0.002[3d]).　　 结论：　　 1.TLR9信号通路在脑缺血再灌注过程中被激活，并向下游传递信号。　　 2.脑梗死后的缺血组织早期以炎症反应为主，促炎因子TNF-α的表达量高于神经保护因子IFN-β的表达量。