猪既是重要经济动物,又是一种理想的医学模型动物,获得猪多能干细胞对动物育种和再生医学研究有重要意义。但是,目前没有猪ESCs建系的报道,已报道建系的(包括本实验室之前报道的)猪iPS细胞依然存在诸多问题。深入研究猪多能性相关基因,发掘猪与小鼠和人的信号通路差异,能够为我们理解猪多能干细胞的分子调控机制提供帮助。国内外已经建系的猪iPSCs细胞中,EpCAM(epithelial cell adhesion molecule)呈现高表达。在人和小鼠中,EpCAM也可作为指示多能性的标记物而用于iPS和其他多能细胞的鉴定和筛选。除了作为多能性标记物外,EpCAM的胞内水解产物EpICD可进入细胞核,调节某些基因的表达。本研究以猪EpCAM基因和蛋白作为研究对象,通过检测EpCAM在猪组织和已经建系的猪iPS细胞中的表达情况,明确了EpCAM和猪多能性之间存在的联系;通过在iPS细胞中敲低和超表达EpCAM,建立了EpCAM与猪多能基因的调控关系;通过在猪体细胞向iPS诱导重编程过程中敲低或超表达EpCAM,发现了EpCAM及其裂解产物EpICD对细胞重编程过程起重要调控作用;最后,通过进一步对EpCAM蛋白调控和信号通路的研究,明确了EpCAM在猪多能细胞中的作用方式和途径。1.EpCAM基因的转录谱及其表达调控本研究通过检测猪组织、iPS细胞、早期胚胎发育过程中和细胞重编程过程中EpCAM的表达变化,试图建立EpCAM与猪多能性之间的联系;通过构建猪EpCAM启动子报告载体,尝试了解猪EpCAM基因在iPS细胞中的表达调控情况。结果表明,猪各组织中均能检测到EpCAM的表达,而在上皮细胞丰富的器官组织中,EpCAM表达量更高。在对建系的猪iPS细胞和猪成纤维细胞的比较中,EpCAM在各株iPS细胞中的表达水平均高于其前体细胞PEF,说明在重编程过程中EpCAM被激活;EpCAM的表达模式与关键的多能基因呈正相关,而与胚层分化基因呈现负相关;EpCAM的表达还与MET的相关基因呈现一定的相关性。对早期胚胎中的多能基因表达分析结果则说明,EpCAM在猪早期胚胎中的表达模式与关键多能基因的表达模式类似。OCT4和SOX2蛋白对EpCAM启动子具有下调作用,而KLF4、c-MYC、NANOG、LIN28、SALL4和ESRRB等多能转录因子对EpCAM启动子具有上调作用。2.EpCAM在细胞重编程过程中和iPS细胞中的调控作用利用构建的shRNA干扰载体和EpCAM超表达载体,观察其对PEF细胞诱导重编程过程的影响。敲低EpCAM表达会降低iPS诱导中的AP(alklin phosphatase,碱性磷酸酶)阳性克隆形成率,而超表达EpCAM则能够显著提高AP阳性率。在建系的猪DOX-iPS细胞中敲低EpCAM,导致内源OCT4、SOX2、LIN28、SALL4和ESRRB的表达显著下调,而超表达EpCAM则导致这些基因的显著上调。另外,敲低内源EpCAM的表达,DOX-iPS细胞克隆团的形态会出现松散状,表明EpCAM敲低导致的内源多能基因下调,进而造成iPS细胞出现分化状态。3.猪EpCAM相关信号通路本研究发现,猪EpCAM在细胞膜上经蛋白酶水解,能够产生一个胞内多肽EpICD。通过利用小分子抑制剂抑制蛋白酶TACE和PS-2活性,可以降低EpCAM的裂解,减少EpICD的产生。通过RT-PCR检测发现,在猪不同组织细胞中TACE和PS-2的m RNA水平存在差异,表明在不同细胞中,EpCAM可能存在不同的裂解效率,从而产生不同丰度的EpICD来调控其下游基因。通过在DOX-iPS细胞中添加TACE和PS-2的抑制剂,会使EpCAM靶基因OCT4,SOX2,LIN28和ESRRB等的表达量下调,说明EpCAM的转录调控作用是由其裂解产生的EpICD实现的。将超表达EpICD的载体转染DOX-iPS细胞,可以显著促进iPS细胞中EpCAM下游靶基因的表达水平。在对PEF细胞进行诱导重编程时,超表达EpICD可以提高形成克隆的AP阳性率。但是,在非iPS细胞培养条件下,在PEF中超表达EpICD无法激活EpCAM下游靶基因,而在培养体系中添加GSK3抑制剂CHIR99021,则EpCAM靶基因启动子可以被激活。原因是GSK3对beta-CATENIN的降解具有促进作用,抑制GSK3的表达可以提高beta-CATENIN的水平。因此,EpCAM依赖beta-CATENIN信号通路来发挥对下游靶基因的转录调控作用。