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猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一种高度接触性、破坏性传染病,又称古典猪瘟或猪霍乱。死亡率高达80%90%,是严重危害养猪业的重要传染病之一,该病的流行和爆发给养猪业带来了巨大的经济损失。当前CSF防治的主要手段是疫苗接种,其中中国研制的猪瘟兔化弱毒疫苗在中国乃至世界范围内CSF的防控起到了积极作用。但我国CSF流行情况仍然复杂,为控制该病的流行,预防该病的爆发,研制出一种高效、安全的新型疫苗已经成为必然趋势。纳米技术在疫苗学中的应用,尤其是过去的十年中呈现出指数增长的趋势。纳米材料无论是作为投递系统增强抗原加工,还是作为一种免疫刺激佐剂激活或强化免疫,都得到了广泛的应用。纳米金颗粒（AuNPs）由于其颗粒小、毒性低以及良好的生物相容性,可以作为疫苗载体来呈递抗原从而提高疫苗的免疫效果,是制备纳米疫苗的理想材料。CSFV E2蛋白作为病毒粒子囊膜上的主要保护性结构蛋白,是CSF亚单位疫苗理想的候选抗原。本研究通过将CSFV的主要保护性抗原E2囊膜糖蛋白与AuNPs偶联,将E2蛋白多重展示于AuNPs表面,制备新型纳米疫苗E2-AuNPs,通过免疫小鼠对其免疫效果进行评价。为研制新型疫苗提出了一种新思路,并奠定了一定的理论与实践基础。总体实施方案主要分为以下几个部分:1.纳米金颗粒（AuNPs）的制备与鉴定采用Turkevich方法制备AuNPs。将1 mL 1%水合四氯金酸（HAuCl4）（10 mg/mL）加入到100 mL双蒸水（ddH2O）中,使其在剧烈搅拌下沸腾。将8 mL的1%柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O）（10 mg/mL）加入沸腾的溶液中,反应15 min后,溶液颜色变红,反应停止。通过透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）对所得AuNPs的形状,大小和Zeta电位进行表征,结果显示AuNPs粒径约为24.4 nm,Zeta电位为-34.3 mV。通过紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）扫描表面等离子体共振来监测AuNPs,显示在λmax=523 nm处有最大吸收峰。2.CSFV E2蛋白的表达、纯化及鉴定参照NCBI数据库中猪瘟病毒兔化弱毒疫苗E2蛋白的氨基酸序列,由生工生物工程（上海）股份有限公司将无核定位信号和去除跨膜区的CSFV E2蛋白的编码序列在大肠杆菌（E.coli）表达系统中进行密码子优化,并克隆到pUC57载体中。以pUC57-E2为模板,构建pET-28a-E2重组表达质粒,并在感受态细胞BL21（DE3）中通过Isopropylβ-D-Thiogalactoside（IPTG）诱导表达。通过SDS-PAGE和Western blot结果显示,在43 kDa处有蛋白条带,与预期结果一致,目的蛋白主要以包涵体形式存在,并能与CSFV阳性血清反应。将E2蛋白通过变性、纯化、复性后,得到可溶性E2蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot检测蛋白,结果显示,在43 kDa处有单一的蛋白条带且能被抗CSFV单克隆抗体识别,表明纯化复性蛋白纯度较高且活性良好。3.纳米金颗粒-E2蛋白颗粒抗原（E2-AuNPs）的制备及物理表征通过将1 mL E2蛋白与1 mL AuNPs（0.2 mg/mL）在4℃条件下混合搅拌1 h,离心（17000 g,30 min）收集上清液用于蛋白浓度测定,沉淀悬浮于10 mM Tris-HCl中制备纳米金颗粒-E2蛋白颗粒抗原（E2-AuNPs）。通过TEM观察显示,偶联后金颗粒周围形成一圈蛋白晕（Corona）;DLS测定显示,偶联后金颗粒粒径由24.4 nm增加至78.8nm,Zeta电位由-34.3 mV增加至-26.1 mV;UV-Vis显示,偶联后E2-AuNPs最大吸收波长由λmax=523 nm迁移至530 nm,以上数据均表明纳米金颗粒与E2蛋白成功偶联并且形成稳定的颗粒复合物。4.E2-AuNPs的生物学评价E2蛋白和E2-AuNPs按梯度稀释包被于96孔板上,通过酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）进行生物学评价,结果显示E2-AuNPs具有与E2几乎相同的抗原活性。采用间接免疫荧光法（Indirect immunoinfluscent assay,IFA）检测抗原呈递细胞（Antigen presenting cells,APCs）对E2和E2-AuNPs的摄取情况,结果显示E2-AuNPs组内化到APCs中的E2蛋白数量多于E2蛋白组,且通过细胞毒性试验显示AuNPs对APCs不产生细胞毒性作用。5.猪瘟病毒CSFV E2蛋白纳米疫苗（E2-AuNPs）的免疫学评价取6周龄的雌性BALB/c小鼠,每组5只,随机分成6组。每只小鼠皮下注射100μL疫苗,每组疫苗组成为E2、E2-AuNPs、E2-CpG、E2-AuNPs-CpG、E2-弗氏佐剂、E2-AuNPs-弗氏佐剂。初次免疫3周后加强免疫,免疫后第0 d,21 d,42 d收获血清,通过ELISA方法进行检测;免疫后49 d处死小鼠取其脾脏,用小鼠淋巴细胞分离培养基分离淋巴细胞进行T淋巴细胞增殖测定。结果显示,无论在有无佐剂的情况下,AuNPs均可以显著提高E2蛋白特异性抗体水平;E2-AuNPs组诱导的刺激指数（Stimulation index,SI）显著高于E2蛋白组和AuNPs组。本研究的意义在于成功建立了CSFV重组E2蛋白包涵体复性的体系,成功制备了CSFV E2蛋白新型纳米疫苗,并对其免疫效果进行评价分析。这些研究表明AuNPs作为一种抗原载体能很好的增强免疫应答。因此,抗原蛋白与AuNPs的结合将是一种简单而有效的新型结构疫苗制备策略。