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家养动物寄生线虫是一大类疫病的病原,其中捻转血矛线虫是严重影响牛、羊养殖业健康发展最常见的寄生虫病之一。其治疗手段主要依赖于伊维菌素等广谱的驱虫药。该类药物的使用不仅会造成环境污染、化药残留,而且会使线虫产生耐药性。为了避免抗药性的继续蔓延,寻找新型防控寄生线虫的方法迫在眉睫。我国一直致力于绿色健康生产方式的实施和可持续发展战略,生物防治逐渐进入人们的视线。其中,捕食线虫真菌（Duddingtonia flagrans,D.flagrans）作为一个重要的生物防治动物寄生线虫的候选菌种,主要包括菌丝和孢子（厚垣孢子和分生孢子）两个阶段,通常菌丝可产生捕食结构对线虫进行捕杀,其抗虫机制仅局限于菌丝体穿透线虫角皮而造成线虫机械性损伤外,是否存在其他抗虫机制目前尚不可知。本研究团队前期研究发现D.flagrans厚垣孢子在培养的过程中存在休眠现象,此时孢子无法产生菌丝,进而丧失抗虫活性。但其休眠形成和解除休眠的条件尚未报道。此外,真菌是众多药用小分子化合物的重要来源,那么该菌在其生长后期产生的次生代谢产物是否与菌丝体一样具有抗捻转血矛线虫的作用,目前尚未可知。厘清D.flagrans厚垣孢子休眠特性及解除休眠条件是研究D.flagrans抗捻转血矛线虫作用的前提条件。为此,本研究对D.flagrans厚垣孢子休眠特性及抗捻转血矛线虫作用机制进行了研究,具体如下:一、捕食线虫真菌D.flagrans厚垣孢子休眠特性（1）不同生理阶段厚垣孢子形态结构:采用MTT染色法、激光共聚焦观察等手段,发现休眠孢子细胞壁明显厚于非休眠孢子,且细胞核也较为完整。非休眠孢子细胞质呈较小的颗粒状,而休眠孢子细胞质融合形成几个较大的团块。结果表明细胞壁厚度和细胞核完整度是区分休眠和非休眠孢子的关键。（2）理化因素对厚垣孢子的影响:利用不同温度、p H、光照、高渗环境、干燥等物理因素以及6种碳源和3种氨基酸对厚垣孢子萌发率的影响,本研究结果提示孢子最佳萌发温度为30℃、p H值为6-8,可见光照射可抑制孢子萌发而紫外线照射后孢子萌发率并未显著下降,缺氧可显著降低孢子萌发率,各种干燥方式中,尤以真空冷冻干燥使孢子萌发率下降为最快。此外,0.03%精氨酸、1%果糖、0.3%赖氨酸能够显著促进孢子萌发（p<0.05）,1%海藻糖和甘油能够显著地抑制孢子的萌发（p<0.05）。本研究结果提示温度、p H、缺氧及真空冷冻干燥是影响D.flagrans厚垣孢子萌发率最重要的因素。（3）不同生理阶段厚垣孢子相关物质含量的测定:采用气质联谱法检测发现非休眠孢子含有一种饱和脂肪酸和一种不饱和脂肪酸,休眠孢子检测出一种饱和脂肪酸和两种不饱和脂肪酸,非休眠孢子中则包括两种饱和脂肪酸和七种不饱和脂肪酸。非休眠孢子中海藻糖含量显著高于休眠孢子（p<0.05）,甘油含量显著低于休眠孢子（p<0.05）,两者中葡萄糖差异不显著。休眠孢子中c AMP的含量均显著高于非休眠孢子（p<0.05）;休眠孢子中蛋白含量高于非休眠孢子,结果表明了脂肪酸种类、海藻糖、甘油及c AMP是影响厚垣孢子休眠的重要因素。（4）休眠孢子解除休眠条件研究:采用真空冷冻干燥法对孢子进行干燥处理,结果表明培养时间越长孢子萌发率越低,培养湿度越高与萌发率越高,孢子在脱水的环境中进入结构性休眠。休眠孢子于4℃、-20℃及28℃（RH9095%）贮存后可解除休眠。揭示了培养时间和冷冻干燥是厚垣孢子休眠的理化基础,储存温度和湿度是厚垣孢子解除休眠的重要因素,可为研究厚垣孢子解除休眠提供依据。二、捕食线虫真菌D.flagrans抗捻转血矛线虫作用机制:（1）不同处理对厚垣孢子抗捻转血矛线虫作用的影响:将不同方式处理的厚垣孢子与捻转血矛线虫三期幼虫共孵育。结果表明70℃、p H1-3、5%饱和氯化钠溶液及紫外线照射是降低厚垣孢子杀虫率的主要原因,而-20℃处理是厚垣孢子维持杀虫率的重要因素。（2）D.flagrans抗捻转血矛线虫作用机制:将D.flagrans乙酸乙酯粗提物中半萜环氧环己烯类化合物NF1702-1和NF1702-2分别与捻转血矛线虫三期幼虫共孵育后进行抗捻转血矛线虫作用机制研究,同时利用D.flagrans发酵液和菌丝对模式线虫（秀丽隐杆线虫）进行了相关的比较研究。采用JC-1法和Mitosox法分别检测捻转血矛线虫和秀丽隐杆线虫虫体线粒体膜电位和活性氧含量,发现两种线虫虫体线粒体膜电位均显著降低,而活性氧含量及凋亡相关基因的表达量则显著升高。通过Western blot检测MAPK信号通路主要分子的磷酸化情况,结果表明捻转血矛线虫和秀丽隐杆线虫虫体p38和JNK磷酸化水平显著升高（p<0.05）。此外,秀丽隐杆线虫ERK磷酸化水平也显著升高。上述结果提示D.flagrans乙酸乙酯粗提物及活性单体在发挥抗捻转血矛线虫作用的同时可能参与细胞凋亡通路和激活MAPK信号通路。采用RNA干扰捻转血矛线虫ced-3基因,与对照组相比,可显著降低捻转血矛线虫三期幼虫ced-3表达水平（p<0.05）。综上所述,该研究初步明确了D.flagrans厚垣孢子休眠及解除休眠相关特性,确定了不同处理对厚垣孢子抗捻转血矛线虫作用的影响,在此基础上发现D.flagrans乙酸乙酯粗提物及活性单体对捻转血矛线虫具有杀伤作用,可能参与细胞凋亡通路和MAPK信号通路,为深入研究捕食线虫真菌抗捻转血矛线虫作用提供重要依据。