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棉花黄萎菌病毒Verticillium dahliae chrysovirus1（VdCV1）本实验室已经报道，但对该病毒功能及其基因功能尚未做实验研究。VdCV1是否具有沉默抑制子尚未有研究报道。探明VdCV1是否具有沉默抑制子对于探明病毒VdCV1的作用机制具有重要意义。本实验将对VdCV1所含的4个基因编码的蛋白能否抑制植物的RNA沉默进行探索。 本研究首先以植物表达载体PH7WG2D为基本骨架，通过Gateway技术的BP反应构建入门载体，入门载体与PH7WG2D改造后的表达载体pJC31通过LR反应构建表达载体。本实验通过这种方法成功构建了表达RdRP蛋白，CP蛋白及OTU蛋白的植物表达载体pJCH-VcR1ORF，pJCH-VcR2ORF，pJCD-VcR4ORF，经酶切鉴定、PCR鉴定和测序分析表明载体构建成功另外，通过酶切连接法，成功构建了未知功能蛋白表达载体pCB301-VCR3ORF。 采用农杆菌瞬时表达法沉默抑制实验，将pJCH-VcR1ORF、pJCH-VcR2ORF、pJCD-VcR4ORF、pCB301-VCR2ORF质粒农杆菌分别于pBIGFP农杆菌共浸润注射接种本生烟或转基因本生烟植株16C，并以质粒农杆菌PJCH-CM、pCB301处理为阴性对照。 实验中紫外灯下绿色荧光观察结果显示：VcR1、VcR2基因处理组在第3、4天时比阴性对照组的绿色荧光强，第5天荧光差异明显减小；p19阳性对照组的荧光亮度全过程比VcR1、VcR2基因处理组的荧光亮度强且持续稳定。Western blot分析GFP蛋白表达的时序过程，结果显示：在第3、4天，VcR1、VcR2基因处理组比阴性对照组GFP蛋白表达量大，第5天GFP表达量差异明显减小。Northern blot分析目的基因表达时序过程，结果显示：VcR1、VcR2基因在植物中瞬时表达量在第3、4天表达量相对较大，第5天明显减少。因此综合分析认为VdCV1的VcR1基因编码的RdRP蛋白和VcR2基因编码的CP蛋白可能是植物RNA沉默的2个弱的抑制子。 经多次重复实验，紫外灯下绿色荧光观察，VcR4处理组与VcR3处组的荧光在实验的第3至7天与对照没有差异，因此确认VdCV1的VcR4编码的OTU蛋白和VcR3编码的未知功能蛋白在烟草中不能抑制基因沉默。