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托品烷生物碱（tropane alkaloids, TAs）是一类从茄科特定的植物中提取的含氮小分子有机物, 主要包括为莨菪碱、山莨菪碱、东莨菪碱等，其中，莨菪碱和东莨菪碱在在临床上作为抗胆碱药物广泛用于镇痛, 麻醉、戒毒脱瘾和帕金森病的治疗。由于野生 TAs药源植物中，托品烷生物碱含量极低，TAs的市场供求矛盾日益突出。因此，利用分子生物技术, 通过引入 TAs 生物合成途径关键酶基因或调节蛋白基因来打破特定的限速步骤，从而显著增加靶向产物莨菪碱和东莨菪碱的含量，是目前TAs代谢工程领域的主要研究方法，而开展对TAs生物合成途径基因的功能鉴定是这一切的前提。颠茄是《中国药典》收录的重要的 TAs商业药源植物. 目前对以颠茄主要研究对象的 TAs 生物合成途径的解析取得了一定的进展, 然而，有一些步骤依然, 尚未明确。目前的研究表明，TAs的生物合成起始于鸟氨酸和精氨酸的脱羧反应。目前对腐胺生物合成的研究多集中于对 ADC 和ODC 作用的评价，而对于精氨酸酶的在 TAs 生物合成的的研究鲜见报道，这严重限制了我们对 TAs生物合成机制的理解和对相关基因的利用，因此本文以颠茄为材料对精氨酸酶基因展现了相关的研究。相关研究结果如下：
本实验根据颠茄转录组数据库，筛选获得了一条精氨酸酶基因（AbARG）,其编码区全长为1014bp，该序列编码338个氨基酸多肽, 分子量为37kDa，等电子点为 5.78。氨基酸序列比对显示，AbARG 在氨基酸水平上与植物精氨酸酶基因具有较高的相似度，如与烟草的一致性为 96.2%，与番茄的一致性为 88.5%，与葡萄的一致性为88.3%。AbARG与动物和微生物的精氨酸酸的氨基酸相似度极低，如与人的精氨酸酶的相似度仅为 16.1%，而与枯草芽孢杆菌的相似度也仅为 20%。而进化树分析也显示了植物的 AbARG 与烟草精氨酸酶亲缘关系最近。整体而言，植物界的精氨酸酶与微生物和动物的精氨酸酶在进化上亲缘关系较远。利用荧光定量 PCR技术分析了 AbARG的组织表达模式，研究结果表明，AbARG与已报道的TAs生物合成途径基因的组织表达模式有所不同，PMT、H6H表达具有根特异性，而AbARG在根、茎和叶等组织中均有类似水平的表达。
在大肠杆菌中对 AbARG 进行了原核表达，利用镍柱纯化获得了纯度较高的重组蛋白，以精氨酸为底物对重组蛋白进行了活性鉴定。TLC 实验结果表明AbARG 能够催化精氨酸转化为鸟氨酸, 即其具有精氨酸酶活性。酶动力学研究结果表明，AbARGKcat为51.18 s-1，Km值为45.9±+3.25 mM，Vmax为1198.52±+83.75 nmol s-1mg-1。
为了研究 AbARG在 TAs生物合成中的作用，本研究构建了 AbARG过表达载体和干扰载体利用发根农杆菌 C58C1介导转化颠茄外植体，在相关发根中均能在转基因发根中均能够检测到抗性基因 NPTII 和目的基因的存在，而在对照发根中检测不到 NPTII 的存在。荧光定量 PCR 检测结果表，AbARG 在过表达发根中的表达量得到显著提高，而干扰发根中 AbARG 的表达量显著性降低，这表明我们获得了理想的转基因发根。过表达 AbARG 发根 TAs 含量检测表明，过表达AbARG 对颠茄发根中莨菪碱、山莨菪碱及东莨菪碱含量无明显作用。而在干扰发根中，莨菪碱及山莨菪碱的含量都得到了显著性的降低，这表明 AbARG 的表达量的降低能够显著抑制TAs的生物合成。
综上所述，AbARG展现出与植物界特别是烟草的精氨酸酶高度的氨基酸相似度和亲密的进化关系。与 TAs生物合成途径基因组织表达模式不同的是，AbARG不具有组织表达特异性。酶动力学研究表明，AbARG 能够高效的将精氨酸转化为鸟氨酸。AbARG 的过表达对颠茄发根的 TAs 的生物合成无明显影响，但是AbARG 表达量的降低显著抑制了颠茄发根中 TAs 生物合成。以上研究表明AbARG在 TAs的生物合成中扮演着重要的角色，该研究对于解析 TAs的生物合成机制具有重要的理论意义。
本实验根据颠茄转录组数据库，筛选获得了一条精氨酸酶基因（AbARG）,其编码区全长为1014bp，该序列编码338个氨基酸多肽, 分子量为37kDa，等电子点为 5.78。氨基酸序列比对显示，AbARG 在氨基酸水平上与植物精氨酸酶基因具有较高的相似度，如与烟草的一致性为 96.2%，与番茄的一致性为 88.5%，与葡萄的一致性为88.3%。AbARG与动物和微生物的精氨酸酸的氨基酸相似度极低，如与人的精氨酸酶的相似度仅为 16.1%，而与枯草芽孢杆菌的相似度也仅为 20%。而进化树分析也显示了植物的 AbARG 与烟草精氨酸酶亲缘关系最近。整体而言，植物界的精氨酸酶与微生物和动物的精氨酸酶在进化上亲缘关系较远。利用荧光定量 PCR技术分析了 AbARG的组织表达模式，研究结果表明，AbARG与已报道的TAs生物合成途径基因的组织表达模式有所不同，PMT、H6H表达具有根特异性，而AbARG在根、茎和叶等组织中均有类似水平的表达。
在大肠杆菌中对 AbARG 进行了原核表达，利用镍柱纯化获得了纯度较高的重组蛋白，以精氨酸为底物对重组蛋白进行了活性鉴定。TLC 实验结果表明AbARG 能够催化精氨酸转化为鸟氨酸, 即其具有精氨酸酶活性。酶动力学研究结果表明，AbARGKcat为51.18 s-1，Km值为45.9±+3.25 mM，Vmax为1198.52±+83.75 nmol s-1mg-1。
为了研究 AbARG在 TAs生物合成中的作用，本研究构建了 AbARG过表达载体和干扰载体利用发根农杆菌 C58C1介导转化颠茄外植体，在相关发根中均能在转基因发根中均能够检测到抗性基因 NPTII 和目的基因的存在，而在对照发根中检测不到 NPTII 的存在。荧光定量 PCR 检测结果表，AbARG 在过表达发根中的表达量得到显著提高，而干扰发根中 AbARG 的表达量显著性降低，这表明我们获得了理想的转基因发根。过表达 AbARG 发根 TAs 含量检测表明，过表达AbARG 对颠茄发根中莨菪碱、山莨菪碱及东莨菪碱含量无明显作用。而在干扰发根中，莨菪碱及山莨菪碱的含量都得到了显著性的降低，这表明 AbARG 的表达量的降低能够显著抑制TAs的生物合成。
综上所述，AbARG展现出与植物界特别是烟草的精氨酸酶高度的氨基酸相似度和亲密的进化关系。与 TAs生物合成途径基因组织表达模式不同的是，AbARG不具有组织表达特异性。酶动力学研究表明，AbARG 能够高效的将精氨酸转化为鸟氨酸。AbARG 的过表达对颠茄发根的 TAs 的生物合成无明显影响，但是AbARG 表达量的降低显著抑制了颠茄发根中 TAs 生物合成。以上研究表明AbARG在 TAs的生物合成中扮演着重要的角色，该研究对于解析 TAs的生物合成机制具有重要的理论意义。