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冷诱导RNA结合蛋白(Cold inducible RNA-binding Protein,CIRP)是一种最初在小鼠睾丸细胞中克隆和鉴定的冷休克蛋白,并且随着细胞冷应激而过量表达。多种细胞应激都可诱导CIRP表达,如氧化应激、渗透压应激及紫外应激等。冷应激时CIRP作为RNA分子伴侣可以促进mRNA的翻译,可以抑制细胞生长,可能参与人和动物的多种生理学过程和病理学过程,可以说冷诱导RNA结合蛋白是一种多功能的蛋白。近些年研究表明CIRP的表达与雄性不育、肿瘤和癌症等多种疾病有关,因此,检测CIRP的表达情况为今后研究其作用机制、功能及其在疾病治疗中的应用提供新的线索。本研究主要从冷刺激时间和刺激强度上研究大鼠心脏、肺脏、大脑和睾丸四种组织中CIRP的表达,分析CIRP的表达与冷刺激之间的关系,验证CIRP的表达是否存在规律性。大鼠正常饲养于20±1℃,冷刺激试验则将大鼠置于-10±1℃、-4±1℃、0±1℃、4±1℃和10±1℃五种环境温度条件下,且在冷刺激后不同时间点采样。本实验采用Western blot方法和荧光定量PCR方法从蛋白质水平及mRNA的水平检测冷刺激后大鼠心脏、肺脏、大脑和睾丸四种组织中的CIRP的表达。荧光定量PCR方法采用双标准曲线法对CIRP mRNA进行相对定量检测,先从GenBank上公布大鼠的CIRP和持家基因GAPDH的核酸序列设计两对特异性引物并合成。采用Trizol法提取组织的总RNA,通过反转录合成cDNA并进行PCR的扩增,基因纯化后与T载体连接并将重组质粒转化入E. coli TG1感受态细胞中,经蓝白斑筛选、PCR、酶切、测序鉴定获得阳性菌液。根据重组质粒标准品建立标准曲线,再经过软件分析得出计算出样本中CIRP mRNA的相对表达量,并以目的基因CIRP和内参GAPDH mRNA含量的比值作为评价CIRP表达水平的指标。实验结果:(1)冷刺激可以诱导CIRP表达,随着冷刺激时间不同CIRP的表达存在一定规律的变化且在正常状态下大鼠四种组织中存在一定的CIRP的表达。(2)Western blot方法检测结果显示在约18kD处可见一条特异性条带,表明在冷刺激后不同时间都存在CIRP的表达,只是其表达量的各不相同。(3)荧光定量PCR结果表明目的基因CIRP与持家基因GAPDH所构建的标准曲线的线性关系良好;冷刺激后,大鼠心脏、大脑和睾丸CIRP表达均高于正常对照组,且组间差异不显著。急性冷刺激后0h-6h表达量升高,6h达到峰值,随后表达呈现下降趋势;肺脏在冷刺激后CIRP的相对表达量低于正常对照组,其变化趋势与心脏、肺脏和睾丸相反。慢性冷刺激后各时间点大鼠心脏、肺脏、大脑和睾丸四种组织中CIRP的表达量相近且组间差异不显著。冷刺激后心脏、大脑和睾丸中CIRP的表达升高可能为研究治疗脑损伤、心脏病、睾丸损伤以及雄性不育等疾病提供新的途径。