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细菌耐药性是细菌抵抗药物杀伤或抑制作用的一种表型,是制约临床细菌疾病预防和治疗的一个重要因素。随着抗菌药物的研究与发展,其临床应用也越来越广泛,甚至一些滥用现象也开始频繁出现,这都为细菌耐药性的出现提供了有利条件。近年来,细菌的耐药性问题越来越严峻（Aarestrup 2005）,细菌的耐药性正在朝着高耐药率,多重耐药的方向发展,已经成为了一个严重的人类公共卫生问题。副猪嗜血杆菌（HPS）和猪链球菌（SS）作为全球性的重要的猪传染病病原,近年来随着养猪业的快速发展,其耐药情况也越来越严重,本论文对其耐药机制分别进行了研究,主要的成果如下:1、副猪嗜血杆菌临床分离菌株喹诺酮耐药分子机制研究本研究中,以138株HPS临床分离菌株为研究对象,首先利用E-test药敏纸条分别检测每株细菌对恩诺沙星和左旋氧氟沙星的MIC值,根据2008年颁布的CLSI标准,判定138株HPS的耐药情况分别为:恩诺沙星的耐药率为60.1%,左旋氧氟沙星的耐药率为5.8%,并且左旋氧氟沙星的耐药菌株对恩诺沙星均表现出了高水平的耐药性。进一步,通过测序分析喹诺酮耐药相关基因DNA解旋酶（Gyr A、Gyr B）和拓扑异构酶Ⅳ（Par C、Par E）的突变情况,结合各菌株的耐药性,共发现了10个耐药相关基因突变位点。其中,Gyr A87位点在所有恩诺沙星耐药菌株中的突变率为100%,提示了Gyr A87位点的突变对HPS喹诺酮耐药性形成的重要性;进一步分析发现Par C73位点的突变,能够协助其它相关突变位点增强HPS对喹诺酮药物的耐受性;甚至,本研究中还首次发现了Par E的耐药相关突变位点（Par E551位点的突变）。为了更加直接的证明DNA解旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的突变是引起HPS耐受恩诺沙星和左旋氧氟沙星的原因,本研究中,进行了定向点突变实验,分别为:Gyr A（87D→N）、Par C（73S→R）、Par E（551T→A）,结果发现这3个位点的突变均能使细菌对恩诺沙星和左旋氧氟沙星的MIC值明显升高,证明了DNA解旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的突变确实是引起细菌耐受喹诺酮的重要原因。另外,本研究中继续分析了HPS的假设毒力因子与其喹诺酮耐药性之间的相关性,结果发现HPS的喹诺酮耐药菌株较其敏感菌株,含有更多的假设毒力因子（hhd A、fim B和hsd R）,表明在HPS中,喹诺酮耐药性与其假设毒力因子之间存在正相关性,这一结果不同于以往的任何相关报道,这为该方面的研究提供了新的视野,使其更加全面和丰富。2、猪链球菌R61多重耐药机制的研究R61是本实验室前期工作中发现的一株“超级耐药”猪链球菌,虽然通过比较基因组学分析部分解释了其耐药机制,但是却并不完善,因此,本研究以R61为研究对象,继续对其多重耐药机制展开了研究。首先,将R61在不同条件下培养（分别添加阿莫西林、氯霉素、头孢噻肟、红霉素、左氧氟沙星、四环素,无抗生素添加,以及同时添加上述6种抗生素）,待其生长至对数中期时,分别提取其全菌蛋白。然后进一步通过双向电泳分析药物刺激后R61的差异表达蛋白,共46个（大于2倍）,其中上调表达蛋白32个,下调表达蛋白14个,并分别对这些差异蛋白进行质谱鉴定。为了进一步探索R61的耐药机制,结合各蛋白的功能及特点,选取可能与耐药性相关的13个蛋白（上调9个,下调4个）,分别构建其过表达菌株（上调蛋白构建A7过表达菌株,下调蛋白构建R61过表达菌株）并检测其MIC值的变化情况,结果发现:SSUR610413（β-内酰胺水解酶）和SSUR612137（新陈代谢控制蛋白A）基因的上调,以及SSUR611509（自溶素）的下调,均能够使细菌对药物的MIC值明显变化。另外,SSUR610927（甲基转移酶）基因的上调也能够使A7对红霉素的耐药性明显提升。最终我们发现,R61能够通过诱导β-内酰胺酶产生、增强新陈代谢以及降低自溶素溶解,进而促进其多重耐药性。