目的:磷酸二酯酶-4(phosphodiesterase 4,PDE4)能够特异性催化水解第二信使环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP),调节胞内 cAMP的水平。而PDE4抑制剂可以抑制PDE4的活性,增加细胞内cAMP的积聚。cAMP可进一步通过影响下游的蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)、cAMP反应元件结合蛋白(cAMPresponse-element binding protein,CREB)而发挥生物学作用。已有报道表明,磷酸二酯酶-4抑制剂具有显著的抗焦虑抗抑郁及增强认知的作用,但其不良反应尤其是恶心呕吐限制了此类药物在临床上的应用。本课题组成功合成了新型PDE4抑制剂氯比普兰(chlorbipram),并在酶活性实验测试中证实,氯比普兰可浓度依赖性的抑制PDE4的活性;且前期的研究结果证实氯比普兰在小鼠强迫游泳及悬尾这两个经典行为绝望模型上表现了良好的抗抑郁活性,同时不影响小鼠的自主活动;在对其致呕吐潜能的实验中发现,比格犬在接受氯比普兰灌胃给药后,120 min内没有出现呕吐反应,这一结果表明氯比普兰具有极低的致呕吐潜能。本实验的目在于进一步确证新型PDE4抑制剂氯比普兰的抗抑郁药效及其发挥药效的作用机制。方法:(1)60只雄性Wistar大鼠按体重随机分为正常对照组10只、模型(chronic unpredicted mild stress,CUMS)组50只,分组标号后开始造模。应激方式有:夹尾1 min、昼夜颠倒24 h、鼠笼倾斜24 h、4 ℃冰水游泳5 min、束第一章 磷酸二酯酶4抑制剂氯比普兰抗抑郁药效学及机制的研究缚lh、湿笼24h、强迫游泳15min、饮水剥夺24h、食物剥夺24h、电击足底5 min、频闪应激2 h、独笼24 h,合笼24 h等,每日给予1～2种应激方式。造模后第3周、6周分别进行糖水偏爱实验判定造模是否成功。待模型组动物的糖水偏爱度明显降低,即模型成功后,再根据糖水偏爱实验结果将CUMS组动物随机分为模型组(溶剂处理+CUMS应激)、氯比普兰(0.05、0.15、0.45 mg·kg-1+ CUMS应激)给药组、艾司西酞普兰(Escitalopram,ESC)阳性对照组(5.0 mg·kg-1 +CUMS应激),每组动物10只。药物处理28天后进行糖水偏爱实验(Sucrose consumption test,SCT)、旷场实验(Open field test,OFT)、高架十字迷宫实验(Elevated plus maze,EPM)以及强迫游泳实验(Forced swim test,FST)等行为学实验对氯比普兰进行抗抑郁药效学评价。(2)行为学实验结束后,一部分动物处死取海马组织,用于后续分子生物学实验。ELISA试剂盒检测海马组织中cAMP的浓度;(3)Western Blotting 检测海马组织中 p-PKA、p-CREB、synapsin 1、PSD95的蛋白水平;(4)RT-PCR检测海马组织中BDNFmRNA的水平;(5)另一部分动物处死后取全脑组织,免疫荧光法(Immunofluorescence staining)检测氯比普兰对大鼠海马神经元中BDNF、p-CREB蛋白表达的影响。结果:(1)各剂量氯比普兰处理后,动物的抑郁症状明显得到改善,快感缺失程度明显减弱,同时焦虑症状有所好转,其中高剂量氯比普兰抗抑郁作用尤为显著。旷场实验中,模型组动物的水平运动得分、垂直运动得分与空白对照组相比没有显著性差异,氯比普兰给药也没有影响动物的运动得分,表明氯比普兰及应激并不影响大鼠的自主活动,与此同时,模型组动物的粪便粒数明显低于正常对照组(P<0.001)表明应激能引起动物焦虑。给药后动物的焦虑程度有所缓解。其中中剂量(0.15mg/kg)、高剂量(0.45mg/kg)组动物的粪便粒数高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.05),表明给药后动物的焦虑程度有所改善。强迫游泳实验中,模型组动物的不动时间明显低于空白对照组,且有统计学差异(P<0.01),表明应激引起动物抑郁。而不同剂量药物处理后,动物的不动时间呈现出缩短趋势,其中中剂量(0.15mg/kg)、高剂量(0.45mg/kg)及ESC阳性对照组(5 mg/kg)动物的不动时间明显低于模型组,差异有统计学意义(P<0.5,P<0.01,P<0.01),表明动物的抑郁状态得到改善。高架迷宫实验中,相对于正常对照组,模型组动物在开臂中活动时间占总活动时间的百分比明显下降(P<0.05),给予不同剂量氯比普兰后,各组动物在开臂中活动时间百分比均出现不同程度的升高,动物焦虑样症状有一定程度的改善。ESC阳性对照组(5 mg/kg)动物的开臂活动时间显著高于模型组,且具有统计学差异(P<0.05)。在糖水偏爱实验中,模型组动物的糖水偏爱度明显低于正常对照组(P<0.001),给予各剂量药物处理后,动物的糖水偏爱度均有不同程度的上升。其中,氯比普兰中剂量(0.15 mg/kg)、高剂量(0.45mg/kg)及ESC阳性对照组(ESC 5mg/kg)动物的糖水偏爱度明显高于模型组,差异有统计学意义(P<0.1,P<0.01,P<0.01)。(2)ELISA试剂盒检测结果:CUMS组大鼠海马组织中cAMP的浓度明显低于正常对照组(P<0.05)。高剂量(0.45 mg/kg)氯比普兰能够显著提高cAMP的含量,这一差异有统计学意义(P<0.01)。与此同时,ESC阳性对照组(5 mg/kg)大鼠海马中cAMP浓度同样显著性升高(P<0.05)。(3)Western Blotting结果显示,与正常对照组相比,CUMS组大鼠海马组织p-PKA、p-CREB水平均显著降低;不同剂量的氯比普兰与艾司西酞普兰均可上调海马p-PKA、p-CREB的表达量,其中中剂量(0.15 mg/kg)、高剂量(0.45 mg/kg)、ESC阳性对照组(5 mg/kg)与CUMS组相比有显著性差异。与此同时,CUMS组大鼠海马synapsin 1及PSD95的蛋白表达量显著下降,氯比普兰处理后,synapsin1及PSD95水平明显升高,其中,中剂量和高剂量作用显著。(4)RT-PCR结果表明,CUMS模型组大鼠海马区BDNF的mRNA水平与正常对照组相比显著降低(P<0.001);不同剂量的氯比普兰和艾司西酞普兰均能增加海马BDNF mRNA的水平,其中中剂量(0.15 mg/kg)、高剂量(0.45 mg/kg)、ESC阳性对照组(5 mg/kg)的作用具有统计学意义(P<0.01,P<0.001,P<0.01)。(5)免疫荧光结果与Western Blotting、RT-PCR结果相一致,大鼠经CUMS应激6周后,海马齿状回神经元胞体内p-CREB及BDNF的表达明显降低,而氯比普兰(0.45 mg/kg)及ESC阳性对照组(5 mg/kg)均可不同程度促进海马齿状回神经元胞体内p-CREB及BDNF蛋白的表达。结论:新型PDE4抑制剂氯比普兰,可通过抑制cAMP水解,增加胞内cAMP水平,激活PKA,使CREB磷酸化增加,从而促进BDNF基因转录及翻译,进一步增加突触蛋白synapsin1及PSD95的水平,改善突触可塑性,最终发挥显著的抗抑郁作用。第二章 磷酸二酿酶4抑制剂氯比普兰改善老年小鼠的认知功能障碍目的:PDE4抑制剂可通过抑制PDE4的活性,增加胞内cAMP的聚积,激活cAMP/PKA/CREB信号通路,进一步影响下游信号分子从而发挥多种生物学作用。大量研究表明,PDE4抑制剂在学习记忆的介导过程中发挥十分重要的作用,其中最经典的PDE4抑制剂咯利普兰能够增强记忆并在多种认知障碍模型中验证有效,但其致恶心呕吐的不良反应限制了此类药物的应用。氯比普兰是新型PDE4抑制剂,本课题组前期研究结果表明其对东莨菪碱诱导的学习记忆获得性障碍大鼠模型具有很好的改善作用,并且已采用比格犬证明其仅有微弱甚至没有致呕吐恶心作用。本研究旨在进一步探讨氯比普兰改善认知障碍的作用,将采用具有认知功能障碍的老年小鼠,探讨新型PDE4抑制剂氯比普兰是否具有改善老年小鼠认知功能障碍的作用及其潜在的作用机制。方法:(1)14只20月龄昆明小鼠,16只6月龄昆明小鼠,分别随机分为正常对照组和氯比普兰处理组,给药剂量为0.5 mg/kg。药物处理三周后进行旷场实验(Open field test,OFT)、新物体识别实验(Novel Object Recognition Test,NOR)、水迷宫实验(Morris Water Maze Test,MWM)测定氯比普兰对老年小鼠学习记忆的行为学变化;(2)将动物处死后取海马组织,ELISA试剂盒检测海马组织中cAMP的浓度;(3)Western Blotting 检测海马组织中 p-PKA、p-CREB 蛋白水平;(4)RT-PCR检测海马组织中BDNF mRNA水平的变化。结果:(1)OFT实验结果显示,20月龄正常组小鼠粪便粒数明显多于6月龄正常组小鼠(P<0.05),给予氯比普兰后粪便粒数明显减少。NOR实验结果表明,20月龄正常组小鼠RI明显低于6月龄正常组小鼠(P<0.01),给予氯比普兰后,RI明显升高(P<0.05),达到6月龄正常组小鼠水平。水迷宫实验结果显示,与6月龄正常组小鼠相比,20月龄正常组小鼠穿越平台次数明显减少(P<0.01),第一次到达平台时间明显延长(P<0.05),目标象限的探索时间和路程显著性下降(P<0.01),给予氯比普兰后能明显增加穿越平台次数(P<0.01),缩短第一次到达平台时间(P<0.05),延长在目标象限探索的时间和路程(P<0.01)。(2)ELISA试剂盒分析结果显示,20月龄正常组小鼠cAMP水平明显低于6月龄正常组小鼠(P<0.01),氯比普兰能显著增加cAMP含量(P<0.01)。(3)Western蛋白印迹法结果显示,20月龄正常组小鼠海马内p-PKA、p-CREB的蛋白表达量明显低于6月龄正常组小鼠(P<0.01,P<0.01),而氯比普兰可显著提高p-PKA、p-CREB的表达量(P<0.01,P<0.01)。(4)同样,PCR分析表明20月龄正常组小鼠海马内BDNF mRNA水平明显低于6月龄正常组小鼠(P<0.01),给予氯比普兰能显著提高BDNF mRNA转录水平(P<0.01)。结论:新型PDE4抑制剂氯比普兰可通过抑制cAMP的水解,增加胞内cAMP水平,上调p-PKA、p-CREB蛋白表达量,从而提高BDNF的基因转录水平,最终改善老年小鼠的学习记忆障碍。