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兔巴氏杆菌病(Pasteurellosis)是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)感染引起的呼吸道疾病，为家兔的主要传染病之一。巴氏杆菌的长期存在性造成该病绵延不断，成为家兔养殖业的隐患，影响兔产品的质量和品质及干扰动物试验结果，造成严重的经济损失。研究表明，巴氏杆菌的交叉保护性抗原与铁调节外膜蛋白相关。开发和研制新型高效安全的疫苗成为众望所盼，本试验对兔多杀性巴氏杆菌的重要免疫原进行了较为系统的研究，为进一步研究交叉保护因子奠定基础。 1 兔多杀性巴氏杆菌铁调节外膜蛋白(IROMPs)抗原交叉性试验 分别以含铁培养基和限铁培养基培养4株兔多杀性巴氏杆菌JS、C51-2、C51-3及C51-17株，用刚果红结合试验初步分析铁调节外膜蛋白(IROMPs)表达情况，同时破碎菌体，提取外膜蛋白，经SDS-PAGE比较这4株细菌在正常培养条件、富铁培养条件及限铁培养条件时外膜蛋白的表达差异，结果表明：限铁培养时，细菌表现出对刚果红染料较强结合性，且这4株巴氏杆菌均表达数种高分子量的IROMPs，主要有147 kD、135 kD、99 kD、94 kD、82 kD及72 kD蛋白带，4株之间存在一定的差异，而正常或富铁条件培养时均不表达上述条带。免疫印迹结果显示，正常条件培养的全菌(C51-17株)抗血清中不含有针对IROMPs的抗体，限铁培养的C51-17株IROMPs可诱导机体产生相应抗体，并且能与JS、C51-2及C51-3株的IROMPs发生抗原交叉性反应。同时用间接ELISA检测C51-17株3种IROMP(99 kD、94 kD和87.6kD)的交叉抗体效价，结果这3种抗血清均与其它3株的产生较高的交叉抗体滴度。 2 兔多杀性巴氏杆菌IROMPs小鼠免疫效果评价 比较观察兔多杀性巴氏杆菌C51-17株的IROMPs、OMPs和全菌疫苗的主动免疫及被免疫效果。分别用正常培养基和限铁培养基培养该菌，采用Sarcosyl处理法提取IROMPs和OMPs，同时用正常培养基增殖该菌制备全菌灭活疫苗，以上述三种抗原分别免疫小鼠。主动免疫时用间接ELISA法检测免疫小鼠时的抗体动态变化。4次免疫后分别采集上述抗血清，作1：10倍稀释注射小鼠，每组6只，分别用C51-17和C51-3攻击，比较二者所提供的被动免疫保护力。结果表明，小鼠产生的抗体滴度在21d之前以全菌免疫组滴度较高，之后IROMPs免疫组抗体滴度反超，总体上抗体滴度为：IROMPs免疫组＞全菌免疫组＞OMPs免疫组；被动免疫时，全菌抗血清和OMPs抗血清能够抵抗C51-17株攻击，但对C51-3株提供的保护力较弱；IROMPs抗血清能够兔多杀性巴氏杆菌铁调节外膜蛋白的免疫原性、表位及耐药性的分析提供较高的免痰保护力，C51一17株攻击时能够全部保护，对C51一株攻击时，5/6获得保护.表明仅OMPs具有一定的交叉保护力，为进一步研究交叉保护因子英定基础.3铁离子对多杀性巴氏杆菌外膜蛋白(OMP。)表达及封药性影响的初步分析 铁离子是病原菌在宿主体内生存必需的营养因子之一，外膜蛋白与铁离子的摄取及利用密切相关，同时外膜蛋白在细菌的耐药性中发挥着重要的作用，本研究旨在分析限铁条件对外膜蛋白表达及耐药性的影响.分别用三种培养基培养两株兔多杀性巴氏杆菌Js和Csl一3，提取两株菌在三种培养条件下的外膜蛋白，用SDS一PAGE指纹图讲分析铁离子对细菌外膜蛋白成分的影响，同时比较三种培养条件对细菌药物敏感性的影响.蛋白指纹图语结果表明，这两株细菌在限铁培养时，外膜蛋白指纹图语发生T变异，新增T几条蛋白条带，如147kD、135kD、105kD、99kD、94kD、82kD及72kD等.药歌试验显示，铁离子能够影响细菌对部分药物的敏感性，如限铁培养时表现出对链霉素、庆大霉素、丁胺卡那、新霉素、青霉素G、先锋v和氛嗓酸耐受.推浏限铁培养时，由于细菌外膜蛋白成分的改变或功能的转移导致T细菌耐药性的变化。4从随机肤岸中筛选兔多杀性巴氏杆菌IROMP.99的优势杭原表位 以兔多杀性巴氏杆菌C 51一17株仅OMP一99为目标分子，研究其优势杭原表位.首先用大氛正常血清从原始12肤的随机肤库中筛去非目的噬菌体，接着用仅OMP一99大我抗血清从经上述初筛的肤库中筛选优势杭原表位，按体外生物淘洗(结合、淘洗及富集)程序进行筛选，重复3轮，第2和第3轮时降低杭血清包被浓度，同时升高洗液中吐沮加的浓度.经3轮亲和筛选后，噬菌体的回收率从1.28、1护增加到4.87挑10礴，假阳性率逐轮降低，由23.3%降至0.33%，表明阳性克隆得到了有效富集.从第3轮筛选出的阳性克隆中随机挑取18个进行扩增，然后对这些克隆采用EUSA和竟争EUSA来鉴定其结合性和特异性，发现14个克隆有较强的结合力而不与正常大鼠血清反应.然后从中选择出8个克隆进行测序.结果表明，所挑选的18个克隆均与阳性杭血清有较强的结合性，其中14个克隆能够发生较强抑制作用;从所测8个克隆的氮基酸序列分析，“WHTT”和“TTP”出现频率较高，推测这两个核心序列可能是兔多杀性巴氏杆菌IROMP一99的模拟表位.