应激或称应激反应是指机体在受到各种内、外因素刺激时所产生的一种全身的非特异性应答反应。适度应激有利于机体面对突发性危险时的全面动员,可增强机体的适应能力;而剧烈或慢性应激则会引起机体过度的心理和生理反应,影响生活质量和心身健康。除应激强弱及持续时间外,应激反应还与机体状况、个体经历、认知评价以及家庭、社会的支持密切相关,因此,应激反应具有明显的主观性和个体差异性。脑组织是应激反应的中心器官,健康脑可以调节神经内分泌、免疫和代谢等系统维持机体内稳态,而“脆弱脑”对各器官和系统的调节能力有限,更易使机体出现超负荷应激反应。此外,越来越多的实验表明脑组织是应激反应重要的靶器官之一。慢性应激可以导致大脑海马、杏仁核和前额叶皮层的神经分支、树突棘和突触数减少,对认知功能、情绪调节和自主行为造成损伤,并且这些损伤在老年或患病个体中更加严重。然而,慢性应激对不同基因型个体脑功能、脑结构和脑内代谢物质的影响仍不十分明确。下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic–pituitary–adrenal,HPA)是主要的应激轴,激活后可以释放糖皮质激素(glucocorticoids,GC)。海马是学习和记忆形成的关键脑区,含有丰富的糖皮质激素受体(glucocorticoids receptor,GR),凭借激素与抗体的结合反应,海马不仅可以感受体内糖皮质激素水平的变化,通过负反馈机制对HPA的活性进行调节,而且还是超负荷应激(如,慢性应激)过程中最易受损的组织结构。老龄或疾病状态下,GR表达明显降低,对HPA轴的负反馈抑制作用受损,因此,应激激活的HPA轴难以恢复至基础水平,导致糖皮质激素持续分泌。过量的糖皮质激素进入中枢神经系统,对大脑,尤其是海马组织,具有明显的神经毒性作用,可以引起树突萎缩,抑制神经发生,导致认知功能受损或/和发展为阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)。越来越多的研究表明,过量糖皮质激素导致的脑损伤可能与胰岛素及其相关信号通路有关。如此,在多种激素与多条信号通路的共同作用下,产生一系列的综合性应答,最终引起脑组织内潜在代谢产物的改变。本课题以app/ps1双转基因鼠和野生型c57鼠作为研究对象,通过慢性不可预知性温和应激(chronicunpredictablemildstress,cums)模型模拟多种环境和心理应激因素作用下的应激反应,观察慢性应激对不同基因型小鼠认知功能、神经超微结构、胰岛素及其相关信号通路的影响,并进一步探讨慢性应激导致认知损伤的代谢物质基础。第一部分慢性应激对app/ps1双转基因小鼠认知功能和神经超微结构的影响目的:观察慢性应激对c57及app/ps1双转基因小鼠认知功能和神经超微结构的影响,明确不同基因型对大脑应激耐受力的影响。方法:1采用6月龄雄性app/ps1及c57小鼠,随机分为c57、c57+cums、app/ps1、app/ps1+cums四组。对两种小鼠的cums组进行连续4周的cums干预,建立慢性应激模型。2应激开始前、应激2周时和应激结束后,分别测量各组小鼠的体重,反应小鼠的整体状态。3应激进行到第3周时,通过新异物体实验和水迷宫实验检测各组小鼠的学习记忆能力,并继续应激至第4周末。4应激结束后,刚果红染色和酶联免疫吸附试验分别测定各组小鼠海马区淀粉样斑块、aβ40和aβ42水平。5透射电子显微镜观察各组小鼠海马ca1区神经元及突触形态,分析突触形态相关参数。结果:1应激开始前,四组小鼠体重无明显差异。应激第2周,与c57小鼠相比,c57+cums小鼠和app/ps1小鼠体重均无明显差异(p>0.05);与app/ps1小鼠相比,app/ps1+cums小鼠体重明显降低(p=0.007)。应激结束后,c57小鼠与app/ps1小鼠体重无明显差异;与c57小鼠相比,c57+cums小鼠体重明显下降(p<0.001);与app/ps1小鼠相比,app/ps1+cums小鼠体重明显降低(p<0.001)。每组13只小鼠。2新异物体识别实验结果显示,在熟悉期内,各组小鼠对两物体的触碰时间没有明显差异(p>0.05)。在1h后的识别期内,与app/ps1组小鼠比,app/ps1+cums组小鼠的认知指数明显降低(p=0.015),而其余三组小鼠的认知指数无明显的统计学差异(p>0.05)。每组13只小鼠。3水迷宫实验结果显示,各组小鼠的游泳速度无明显差异(p>0.05)。在定位巡航实验的第4天和第5天,与c57组小鼠相比,app/ps1组小鼠的平均潜伏期均明显延长(p=0.019,p=0.024);在第3天和第5天,与app/ps1组小鼠比,app/ps1+cums组小鼠的平均潜伏期均明显延长(p=0.008,p=0.001);而c57组小鼠与c57+cums组小鼠的平均潜伏期没有显著的统计学差异(p>0.05)。在空间探索阶段,与c57组小鼠相比,c57+cums和app/ps1组小鼠的平台象限探索时间均明显缩短(p=0.017,p=0.001);与app/ps1组小鼠相比,app/ps1+cums组小鼠的探索时间进一步缩短(p=0.007)。每组13只小鼠。4刚果红染色显示,c57和c57+cums组小鼠海马区均无明显的淀粉样斑块沉积(p>0.05);与c57鼠相比,6月龄app/ps1鼠海马区开始出现淀粉样斑块的沉积(p=0.048),并且cums干预可以明显增加淀粉样斑块的沉积(p=0.001)。每组3只小鼠。与刚果红染色结果一致,elisa试剂盒检测结果显示,与c57鼠相比,app/ps1鼠海马区aβ40和aβ42的表达水平均明显增加(p=0.035,p=0.002);与app/ps1鼠相比,app/ps1+cums组小鼠海马内aβ42水平表达升高(p=0.049);而c57和c57+cums组小鼠海马内aβ40和aβ42含量则无明显的统计学差异(p>0.05)。每组8只小鼠。5透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscopy,tem)观察海马ca1区神经元形态,c57与c57+cums组小鼠神经元及神经元内各细胞器结构清晰完整;与c57组小鼠神经元相比,app/ps1组小鼠海马神经元细胞膜完整,基质分布均匀,但细胞内出现脂褐素,胞核、核膜结构完整,部分线粒体存在嵴膜融合,部分高尔基体模糊,内质网轻度扩张;app/ps1+cums组小鼠海马神经元细胞膜部分模糊,胞质苍白,基质不均匀,细胞器数目减少,细胞内呈现较多的脂褐素和自噬小体,胞核核膜模糊、染色质边集,线粒体嵴膜融合严重。20000倍镜下观察各组突触形态,四组小鼠海马ca1区的突触间隙无明显的统计学差异(p>0.05);与c57小鼠相比,c57+cums组小鼠的突触曲率明显降低(p=0.027);与c57小鼠相比,c57+cums和app/ps1小鼠的突触后致密物厚度均明显降低(p<0.001,p<0.001);与app/ps1鼠相比,app/ps1+cums组小鼠的突触后致密物长度明显缩短(p=0.033)。每组29-32个突触。第二部分慢性应激对app/ps1双转基因小鼠胰岛素及相关信号通路的影响目的:探讨慢性应激对c57及app/ps1双转基因小鼠胰岛素及其相关信号通路的改变,明确app/ps1基因型小鼠应激耐受力降低的原因和应激导致认知损伤的分子生物学机制。方法:1模型制备及分组同第一部分。2应激结束后,第二日清晨尾尖血测小鼠血糖,放射性免疫法分别测量血清中皮质酮及胰岛素含量。3应激结束后,制作小鼠脑组织石蜡切片,免疫组织化学染色观察海马ca1区irs1和irs1-pser636蛋白表达情况。4milliplexmapkits检测,四组小鼠海马区ir-ptyr1162/1163、irs1-pser636、jnk-pthr183/tyr185、akt-pser473、mtor-pser2448、p70s6k-pthr389/412、erk1/2-pthr185/tyr187、gsk3α-pser21、gsk3β-pser9、pten-pser380、tsc2-pser380和rps6-pser235/236因子的表达情况。5蛋白印迹分析四组小鼠海马区糖皮质激素受体(gr)表达情况,并进一步验证四组小鼠海马区akt/mtor信号通路的改变。结果:1放射免疫试剂盒检测结果显示,与app/ps1小鼠血清内糖皮质激素水平相比,app/ps1+cums组小鼠血清糖皮质激素水平明显升高(p<0.001),而野生型c57小鼠经历4周的cums应激后,糖皮质激素水平变化不明显(p>0.05),每组8只小鼠。蛋白质印迹结果显示,与野生型c57小鼠比,app/ps1双转基因鼠海马区糖皮质激素受体表达明显降低(p<0.001),并且cums干预可以进一步降低海马内糖皮质激素受体的含量(p=0.001),而c57鼠与c57+cums鼠海马内的糖皮质激素受体含量无明显差异(p>0.05),每组4只小鼠。2利用空腹血糖和血清胰岛素含量计算homa值发现,app/ps1+cums组小鼠的homa值明显高于app/ps1组(p=0.018),而c57、c57+cums和app/ps1三组间的homa值无明显差异(p>0.05),每组8只小鼠。多因子试剂盒检测结果显示,与c57小鼠相比,app/ps1小鼠海马区ir-ptyr1162/1163表达明显降低(p<0.001)。与app/ps1小鼠相比,app/ps1+cums小鼠海马区ir-ptyr1162/1163表达进一步降低(p=0.001)。两组野生型c57小鼠海马内ir-ptyr1162/1163表达无统计学差异(p>0.05)。免疫组织化学染色显示,四组小鼠海马内总irs1蛋白表达无统计学差异(p>0.05)。免疫组织化学和多因子试剂盒检测均发现,与c57组小鼠相比,irs1-pser636在app/ps1组小鼠表达增加(p<0.001,p=0.001)。经历4周的cums后,app/ps1+cums组小鼠海马内irs1-pser636含量明显高于app/ps1组(p<0.001,p<0.001)。两组野生型c57小鼠海马内irs1-pser636表达无统计学差异(p>0.05),每组7-8只小鼠。3多因子试剂盒检测发现,与app/ps1组小鼠相比,app/ps1+cums组小鼠jnk-pthr183/tyr185蛋白表达明显增加(p=0.036),而在c57、c57+cums和app/ps1三组间表达无明显统计学差异(p>0.05)。与c57组小鼠相比,app/ps1组小鼠海马内akt-pser473、mtor-pser2448和p70s6k-pthr389表达显著降低(p=0.002,p<0.001,p=0.001)。经历4周的cums后,app/ps1+cums组小鼠海马内三种磷酸化蛋白的表达进一步降低(p=0.014,p=0.006,p=0.008),而两组野生型c57小鼠海马内三种磷酸化蛋白的表达水平无明显的统计学差异(p>0.05)。与c57组小鼠相比,app/ps1组小鼠erk1/2-pthr185/tyr187表达明显降低(p=0.044),pten-pser380蛋白表达明显增加(p<0.001)。其余,gsk3α-pser21、gsk3β-pser9、tsc2-pser380和rps6-pser235/236因子在四组间表达无统计学差异(p>0.05),每组7-8只小鼠。蛋白质印迹实验进一步证实,两组野生型c57小鼠海马内akt-pser473和mtor-pser2448表达无统计学差异(p>0.05);与c57小鼠相比,app/ps1组小鼠海马内akt-pser473和mtor-pser2448的表达均降低(p=0.002,p=0.018),cums应激导致app/ps1小鼠海马内akt-pser473含量进一步降低(p=0.002),每组4只小鼠。第三部分慢性应激对app/ps1双转基因小鼠脑组织潜在代谢产物的影响目的:采用气相色谱-飞行时间质谱分析系统(gaschromatography-timeofflightmassspectrometryanalysissystem,gc-tof/ms)平台,探讨慢性应激状态下,携带app/ps1基因是否会对认知相关的代谢产物产生影响。方法:1模型制备及分组同第一部分。2慢性应激结束后将小鼠断头取脑,分离海马组织-80℃冰箱储存。用时称取10mg海马组织进行萃取和衍生化,并利用gc-tof/ms系统进行上机检测。每组6只小鼠。3对原始数据进行预处理后,将峰编号、样品名和标准化后的峰面积输入simca13.0软件,依次进行pca、pls-da和opls-da多元统计分析,进一步应用student’t检验对组间筛选出的候选物进行比较,寻找两组间的差异代谢物。4为了寻找应激过程中与认知功能相关的代谢产物,我们将所筛选出的差异代谢物与第一部分水迷宫空间探索测试成绩进行相关性分析,以|pearson相关系数|>0.5和p<0.05为标准进行筛选。结果:1主成分分析(principalcomponentanalysis,pca)得分图显示,除c57与c57+cums两组外,其余各组均分布在不同区域。偏最小二乘法判别分析(partialleastsquaresanalysis,pls-da)得分图显示,c57vsc57+cums,c57vsapp/ps1以及app/ps1vsapp/ps1+cums两两比较时不同组别均分布到不同的区域,r2y值分别为:0.993,0.998和0.993,q2y值分别为:0.574,0.692和0.68,说明该模型稳健并有很好的预测性。此外,7倍的交叉验证和200次置换检验显示两两比较时q2值均较低,进一步证实模型稳健性和预测性良好。为了得到更的精确结果,应用正交偏最小二乘法判别分析(orthogonalpartialleastsquaresdiscriminantanalysis,opls-da)以最大程度的区分两组之间的差异物,结果显示两两比较时不同组别均分布到不同的区域,并且所有样本均在95%可信区间范围内。又根据模型中有意义的变量(variableimportanceintheprojection,vip)>1和相似度>700,c57vsc57+cums有24个变量被选出来,c57vsapp/ps125个变量被筛选出来,app/ps1vsapp/ps1+cums有33个变量被筛选出来。2应用SPSS13.0对这些变量进行进一步统计分析发现,与C57组相比,在APP/PS1组缬氨酸、β-丙氨酸、磷酰乙醇胺和泛酸表达显著降低,山梨糖、棕榈酸和硬脂酸表达显著升高。接受连续4周的CUMS后,与C57组相比,C57+CUMS组单棕榈酸甘油酯表达显著降低,棕榈酸和硬脂酸表达显著升高;与APP/PS1组相比,APP/PS1+CUMS组苏氨酸、丝氨酸、磷酰乙醇胺和单硬脂酸甘油酯表达显著降低,3-羟基丁酸、L-苹果酸和泛酸表达显著升高(P<0.05)。3将所筛选出的差异代谢物与第一部分水迷宫空间探索测试成绩进行相关性分析,以|Pearson相关系数|>0.5和P<0.05为标准,最终发现3-羟基丁酸、缬氨酸、丝氨酸、β-丙氨酸和磷酰乙醇胺与应激过程中的认知改变密切相关。结论:1慢性不可预知性温和应激对不同基因型小鼠脑功能及神经病理的影响并不相同,提示6月龄野生型C57小鼠对慢性应激具有完整且有效的调控力,而同月龄APP/PS1鼠的应激耐受力则明显下降。行为学和神经病理学结果,连续4周的CUMS干预对C57小鼠的认知功能和神经元超微结构无明显影响,但导致APP/PS1小鼠的认知障碍加重,神经元超微结构严重受损,并明显增加海马内老年斑和Aβ42的含量。2与野生型C57鼠相比,6月龄APP/PS1双转基因小鼠受到慢性应激后,糖皮质激素水平急剧升高,糖皮质激素受体表达降低,应激耐受力明显下降,这可能与海马区胰岛素抵抗以及胰岛素抵抗引起的Akt/mTOR信号通路被进一步抑制有关。因此,对脆弱个体或应激易感人群而言,压力控制和体内激素水平的稳态显得更为重要。3慢性不可预知性温和应激可以导致APP/PS1鼠脑内发生代谢紊乱,在这些差异代谢产物中,3-羟基丁酸、缬氨酸、丝氨酸、β-丙氨酸和磷酰乙醇胺与应激过程中的认知改变密切相关,这些代谢产物主要涉及鞘脂类代谢,酮体的合成与分解以及氨酸代谢通路。