背景动脉粥样硬化(AS)及其并发症引起的急性心血管病事件已成为人类的头号杀手,其防治一直是世界性公共卫生的重点和难题。急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)是冠状动脉粥样硬化性心脏病最重要的死因。ACS主要是由于冠状动脉内粥样斑块的破裂及其引起的血栓形成,导致冠状动脉急性管腔狭窄或闭塞所致。从病理生理角度而言,ACS最主要的深层原因是易损斑块,即易于发生血栓或可能迅速进展成为罪犯病变的斑块。近年来的研究表明,动脉粥样斑块内的巨噬细胞凋亡是易损斑块形成的重要原因。尽管巨噬细胞减少导致其分泌基质金属蛋白酶下降,斑块细胞外胶原降解减少而具有稳定斑块的作用,但大量研究证实,巨噬细胞凋亡可通过以下的机制促进易损斑块的形成：1.巨噬细胞数量减少,凋亡的平滑肌细胞和巨噬细胞不能被有效吞噬,发生继发性坏死,胞浆内脂质内容物释放,堆积形成斑块的脂质核心,促进粥样斑块脂质核心的形成；2.巨噬细胞凋亡后释放出胆固醇,导致斑块脂质核心针形胆固醇结晶增多,损伤纤维帽；3.巨噬细胞凋亡后释放促血栓形成物质,尤其是组织因子,促进斑块血栓形成。巨噬细胞凋亡的信号调控是一个复杂的网络体系,在各种动脉粥样硬化危险因子如氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)等的作用下,Akt、核因子-KB(NF-κB)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)等信号分子均参与巨噬细胞凋亡调控过程,但其具体的调节机制还不清楚。Tribbles (TRBs)基因是Groβhans等在果蝇体内发现的一类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶样蛋白基因家族,是抑制有丝分裂、诱导细胞凋亡的核基因,也被称为神经细胞死亡诱导蛋白激酶。人类TRBs基因家族包括TRB1、TRB2、TRB3,果蝇TRB3是哺乳动物的同系物,因此目前有关TRBs基因的研究主要集中在TRB3。TRB3可能具有广泛的生物活性,在肝脏、脾、胸腺、前列腺、胰腺和心脏均有表达。最近的研究认为,TRB3基因是一类重要的信号通路调节蛋白,至少可以通过CDC25/String、Akt和MAPKs信号途径通路发挥作用,并能调节NF-κB信号通路。因此,本研究提出如下假说：TRB3可能参与了ox-LDL诱导的巨噬细胞的凋亡过程,并通过Akt、MAPKs、NF-kB信号转导通路介导巨噬细胞凋亡,从而在动脉粥样硬化易损斑块的发生发展中发挥重要的调节作用。目的1.人单核源性巨噬细胞中TRBs的表达情况；2. ox-LDL对巨噬细胞TRB3的影响；3.TRB3在ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡中的作用及其信号转导机制。方法本研究以原代培养的人单核源性巨噬细胞为研究对象,采用实时定量逆转录聚合酶链反应(real time RT-PCR)、蛋白免疫印迹(western blot)、酶联免疫吸附(ELISA)等实验方法,分别观察：1.在巨噬细胞自然分化第1、3、5、7、9、11天检测TRB1、TRB2、TRB3 mRNA表达水平；2.不同浓度(0、5、10、25、50μg／m1)的ox-LDL、LDL处理巨噬细胞不同时间(0、4、8、12、24、48h)后,检测TRB3 mRNA和蛋白含量；3.TRB3基因克隆及腺病毒表达载体的构建：根据Genebank人TRB3基因序列,设计引物,提取人全血DNA, PCR扩增TRB3基因,回收目的基因并亚克隆至表达载体,经测序鉴定正确后,应用BD Adeno-XTM Expression System 2腺病毒载体构建系统,构建含人TRB3基因的腺病毒质粒。经转染293细胞行病毒包装、扩增及纯化,得到人TRB3腺病毒载体；4.设计、合成、筛选TRB3 siRNA;5.TRB3腺病毒及siRNA分别转染巨噬细胞,观察ox-LDL刺激后巨噬细胞凋亡的变化(MTT检测细胞存活率,ELISA法检测凋亡细胞ssDNA含量,western blot检测caspase-3);6.TRB3腺病毒及siRNA分别转染巨噬细胞,观察Akt、MAPKs及NF-κB信号通路的变化。结果1.人单核源性巨噬细胞中TRBs的表达三种TRBs均能在巨噬细胞中表达,其中以TRB3表达为主,而TRB1、TRB2仅微量表达。在分化的第3天,TRB3 mRNA表达水平即明显上升,第7天表达量达到最高。2. ox-LDL对巨噬细胞TRB3的影响分别以0μg／ml、5μg／ml、10μg／ml、25μg／ml、50μg／ml的ox-LDL、LDL孵育巨噬细胞24h后发现,ox-LDL能有效刺激巨噬细胞TRB3 mRNA表达上调,而LDL作用不明显。ox-LDL刺激巨噬细胞TRB3 mRNA表达的上调呈剂量依赖性。在50μg／ml浓度下,与LDL处理组相比,ox-LDL处理组TRB3 mRNA表达显著升高(P<0.01)。50μg/ml ox-LDL、LDL分别处理巨噬细胞0h、4h、8h、12h、24h、48h后,发现ox-LDL刺激巨噬细胞TRB3 mRNA表达上调还呈时间依赖性。与LDL处理组相比,ox-LDL处理细胞24h后TRB3 mRNA开始明显增加(P<0.05),48h后TRB3 mRNA增加更明显(P＜0.01)。Western Blot进一步证实,50μg/m1L ox-LDL处理巨噬细胞48h后,TRB3蛋白表达量亦显著增加。3.TRB3基因克隆及腺病毒载体构建根据人TRB3基因序列,自行设计引物,成功克隆出了人TRB3基因。经测序分析与已知人TRB3序列完全相符。利用BD Adeno-XTM Expression System 2腺病毒构建系统,成功构建了含人TRB3基因的腺病毒载体(pLP-Adeno/TRB3)。4.TRB3对ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡的影响与对照组相比,巨噬细胞过表达TRB3后,细胞存活率降低(P<0.01),凋亡增加(P<0.05),caspase-3表达量增加,即细胞凋亡增加；过表达TRB3的巨噬细胞经ox-LDL处理后细胞凋亡也增加,即细胞存活率明显下降(P<0.01),凋亡增加(P<0.01),caspase-3表达量增加；但TRB3过表达和ox-LDL处理之间无交互作用。TRB3 siRNA转染巨噬细胞后,与对照组相比,TRB3基因沉默的巨噬细胞凋亡减少,TRB3 RNAi组巨噬细胞存活率升高(P0.01),凋亡减少(P<0.05)；经ox-LDL处理后凋亡进一步增加,TRB3 RNAi/ox-LDL组巨噬细胞存活率亦明显降低(P<0.01),凋亡增加(P<0.01),TRB3基因沉默与ox-LDL处理之间有交互作用(P=0.048,P=0.001),为拮抗作用。5.TRB3对Akt的影响与对照组相比,巨噬细胞过表达TRB3后,p-Akt表达量降低。过表达TRB3的巨噬细胞经ox-LDL处理后细胞p-Akt表达量比单纯ox-LDL刺激组降低。TRB3 siRNA转染巨噬细胞后,与对照组相比,TRB3基因沉默的巨噬细胞p-Akt表达量增加；再经ox-LDL孵育后,与单纯ox-LDL处理组相比其p-Akt表达量也增加,但与TRB3基因沉默组相比p-Akt表达量降低。6.TRB3对MAPKs的影响巨噬细胞过表达TRB3后,与对照组相比,p38的磷酸化水平明显减低；与ox-LDL处理的对照组相比,过表达TRB3的巨噬细胞经ox-LDL处理后p-p38表达量降低。ox-LDL刺激过表达TRB3的巨噬细胞24h后,与空载体对照组相比,c-Fos的活性明显降低约22%,c-Jun的活性也明显降低。与对照组相比,siTRB3组的p38的磷酸化水平表达量明显增加；与ox-LDL处理的对照组相比,转染siTRB3的巨噬细胞经ox-LDL处理后p38磷酸化水平明显增加。ELLISA显示与对照组相比,TRB3基因沉默后c-Fos的活性增加1.3倍,c-Jun的活性增加1.3倍。7.TRB3对NF-κB的影响ox-LDL呈时间依赖性降低NF-κB的活性。Ox-LDL处理细胞24h时NF-κB的活性开始降低,与LDL对照组相比,p50、p65的活性分别降低40%(P<0.05)和21%(P<0.05)。48h时p50、p65的活性分别降低40%(P<0.01)和21%(P<0.01)。但是巨噬细胞过表达TRIB3后,与对照组相比,p50、p65的活性变化差异无统计学意义。结论1.人单核源性巨噬细胞中TRBs的表达以TRB3为主,TRB3主要分布于细胞核内；2. ox-LDL呈剂量和时间依赖性刺激巨噬细胞合成TRB3,；3.TRB3部分参与ox-LDL诱导巨噬细胞凋亡过程；4.TRB3主要是通过抑制Akt、p38 MAPK/AP-1通路参与ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡；5. NF-κB参与ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡,但不参与TRB3介导的巨噬细胞凋亡过程背景内质网位于细胞核附近的胞质区域,是哺乳动物细胞重要的Ca2+贮存器,也是蛋白质合成与翻译后修饰、多肽链正确折叠与装配的重要场所。多种因素如低氧、高血糖、化学毒物等均可使内质网腔内Ca2+耗竭、内质网蛋白质糖基化抑制、二硫键错配、内质网蛋白质向高尔基体转运减少,导致未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网腔内积蓄等,均可使内质网功能发生改变,统称内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ER stress)。内质网应激与多种疾病相关,最近的研究显示,内质网应激参与了动脉粥样硬化的发生和发展。C/EBP同源蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins homologus protein, CHOP)是C/EBPs家族成员之一,具有一个转录激活区和一个与DNA结合的亮氨酸拉链结构,可以调控细胞应激反应过程中众多基因的表达。在非应激的基础状态下,CHOP的表达水平很低,而在细胞外和内质网应激中,其表达量大大增加。在内质网应激中,PERK、ATF6以及IRE-1都能够诱导CHOP的转录,然而PERK-eIF2a-ATF4是CHOP蛋白表达所必需的。通过CHOP基因过表达和CHOP基因敲除的小鼠,CHOP已被证实在内质网应激中作为细胞周期停滞和凋亡的一个诱导物。TRB3是晚近在果蝇体内发现一种抑制有丝分裂的蛋白激酶,TRB3可能不仅是糖尿病糖耐量异常的原因,而且作用于MAPKs及NF-KB等信号通路,在细胞生长、发育、分裂、凋亡等生理反应过程具有相当重要的作用。最近的研究认为,TRB3参与内质网应激的信号转导过程。衣霉素、大麻素、毒胡萝卜素等内质网应激诱导剂,能够刺激TRB3基因的表达,并可以同时上调ATF4和CHOP的表达,但TRB3的mRNA变化要晚于ATF4和CHOP。有研究表明,在内质网应激通路中,TRB3属于下游基因,应激反应时ATF4和CHOP所形成的复合物,通过与TRB3启动子区域的一段33bp碱基重复序列结合后促进TRB3基因的表达。Ox-LDL被认为是AS发生发展过程中的一个危险因素,本研究前期实验发现,ox-LDL呈剂量和时间依赖性刺激人单核源性巨噬细胞中TRB3的表达,并且TRB3部分参与了ox-LDL诱导巨噬细胞凋亡的过程。因此,本研究提出如下假说：ATF4-CHOP可能参与了ox-LDL诱导的巨噬细胞的TRB3表达增加的过程,并通过TRB3参与巨噬细胞凋亡,从而在动脉粥样硬化易损斑块的发生发展中发挥重要的调节作用。目的1.探讨ox-LDL对人单核源性巨噬细胞CHOP、ATF4的调控作用；2.观察ER stress时巨噬细胞TRB3的表达变化；3.探讨巨噬细胞中TRB3与ATF4-CHOP的相互调节作用。方法1.不同浓度(0、2.5、5、10、25、50μg／m1)的ox-LDL、LDL处理巨噬细胞不同时间(0、4、8、12、24、48h)后,检测CHOP、ATF4 mRNA含量；2.2μg／ml衣霉素刺激人单核源性巨噬细胞不同时间(0h、4h、8h、12h、24h、48h)后,检测TRB3 mRNA的表达；3.CHOP表达质粒转染巨噬细胞后,观察ox-LDL刺激后TRB3 mRNA表达的变化；4.构建TRB3重组腺病毒和TRB3siRNA,转染巨噬细胞后,观察TRB3过表达或抑制表达后CHOP mRNA表达的变化。结果1.ox-LDL对巨噬细胞CHOP、ATF4mRNA的影响分别以0、2.5、5、10、25、50的ox-LDL、LDL孵育巨噬细胞24h后发现,ox-LDL能有效刺激巨噬细胞CHOP mRNA表达上调,而LDL作用不明显。ox-LDL刺激巨噬细胞CHOP mRNA表达随ox-LDL剂量增加而逐渐增加,其中50μg/ml ox-LDL刺激作用最强,提示ox-LDL对巨噬细胞中CHOP mRNA表达的上调呈剂量依赖性。与LDL处理组相比,25μg/ml ox-LDL处理组CHOP mRNA表达显著升高(P0.01),50μg/ml ox-LDL处理组增加更明显(P<0.01)。50μg/ml ox-LDL和50p.g／ml LDL分别处理巨噬细胞0h、4h、8h、16h、24h、48h后,发现ox-LDL刺激巨噬细胞CHOP mRNA表达上调,并呈时间依赖性。与LDL处理组相比,ox-LDL处理细胞24h后CHOP mRNA开始明显增加(P<0.05),48h后CHOP mRNA增加更明显(P＜0.01)。50μg/ml ox-LDL亦能促进巨噬细胞ATF4 mRNA的表达,并呈时间依赖性,24h时达到高峰,为LDL对照组的1.6倍(P＜0.01),但峰值表达量低于CHOP(分别为对照组的1.6倍和3倍)。ox-LDL促进巨噬细胞ATF4、CHOP、TRB3 mRNA表达增加时,TRB3 mRNA变化要晚于ATF4和CHOP。2. ER stress对巨噬细胞合成TRB3的影响衣霉素能明显刺激巨噬细胞TRB3 mRNA表达上调,并呈时间依赖性。与对照组相比,衣霉素处理巨噬细胞6h后TRB3 mRNA开始明显增加(P<0.05),8h后TRB3 mRNA增加更明显(P<0.01),24h后TRB3 mRNA表达达到高峰。3.CHOP过表达对巨噬细胞TRB3表达的影响CHOP表达质粒转染巨噬细胞使CHOP过表达后检测TRB3 mRNA,与对照组相比,巨噬细胞过表达CHOP后其TRB3 mRNA明显增加(P＜0.01)。过表达CHOP基因的巨噬细胞经50μg／ml ox-LDL处理后,与对照组相比,ox-LDL刺激组TRB3 mRNA表达水平明显增加(P<0.01)。4.TRB3对巨噬细胞CHOP表达的影响TRB3重组腺病毒转染巨噬细胞使TRB3过表达后,与对照组相比,其CHOP mRNA的表达明显降低(P＜0.05)。采用TRB3靶向siRNA转染巨噬细胞抑制TRB3表达后,与对照组相比较,siRNA抑制巨噬细胞TRB3表达后CHOP mRNA的表达虽然增加,但是差异无统计学意义。抑制TRB3表达的巨噬细胞经ox-LDL处理后,与对照组相比,CHOPmRNA表达明显增加(P<0.01)。结论1. ox-LDL呈剂量和时间依赖性促进巨噬细胞CHOP、ATF4 mRNA表达；2. ox-LDL可诱导巨噬细胞发生ER stress;3.巨噬细胞发生ER stress时以CHOP、ATF4的表达增加为主；4. ER stress促进巨噬细胞TRB3 mRNA的合成；5.CHOP可促进ox-LDL诱导的TRB3表达,TRB3负反馈调节CHOP表达,ATF4-CHOP-TRB3参与ox-LDL导致巨噬细胞凋亡的过程。