背景太白楤木是一种在我国中西部秦岭大巴山脉及其余脉有着丰富野生资源的药用植物。皂苷类化合物是其发挥药理作用的主要成分。我们前期研究发现太白楤木总皂苷在D-半乳糖诱导的大鼠衰老模型中有很好的抗衰老作用,而在太白楤木总皂苷中,含有较高比率的竹节参皂苷Ⅳa（CHS）,并有良好的抗氧化作用。大量的研究表明氧化应激与衰老密切相关,那么CHS能否通过其出色的抗氧化能力起到抗衰老的作用呢?另外,我们前期研究表明CHS具有激活AMPK的作用,而AMPK又可以调控自噬,越来越多的证据显示通过调节自噬能够调节衰老,那么我们有理由推断CHS能够通过调节AMPK从而调控自噬来调节衰老。为了解决上述这些疑问和推断,我们建立了两种有效诱导细胞衰老的模型,从氧化应激和自噬两个方面研究了CHS的抗衰老作用,为有效深入开发太白楤木及其活性成分提供了方向和实验室依据。目的通过建立过氧化氢（H₂O₂）诱导的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）衰老以及MEFs复制性衰老模型,研究太白楤木中主要成分竹节参皂苷Ⅳa的抗衰老作用及机制。方法1.取Balb/c孕鼠,分离小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）体外培养。H₂O₂诱导衰老:取5-8代细胞,加入不同浓度H₂O₂与CHS处理;复制性衰老:MEFs细胞正常培养传代至第15代,中间取第5,10,15代细胞对比检测相关指标。在干预实验中,加入不同浓度CHS,NH4Cl,Compound C对细胞进行处理。2.使用MTT法分别检测H₂O₂与CHS对MEFs细胞活力的影响。3.使用衰老相关的β半乳糖苷酶染色（SA-β-gal）试剂盒,对染色阳性的MEFs细胞计数,从而观察细胞衰老状态。4.使用DCFH-DA荧光探针染色和Mito SOXTM Red线粒体超氧化物检测试剂盒染色,使用流式细胞仪分别检测细胞总ROS和线粒体ROS水平。5.使用MDC染色,荧光显微镜下检测MEFs自噬溶酶体的分布及其数量多少。6.使用m RFP-GFP-LC3腺病毒转染,荧光显微镜下观察红绿荧光比值以及融合后的黄色荧光,检测细胞自噬通量。7.使用透射电镜观察不同代龄的MEFs细胞的自噬小体及衰老相关的超微结构改变。8.使用Western blot检测能够体现衰老状态的蛋白p53,p21,p16,β-gal表达,同时检测Nrf2及其下游的靶分子HO-1,GCLM,GCLC蛋白表达;检测自噬相关蛋白LC3,p62,Lamp 1,Lamp 2,Beclin 1,Atg 7,Atg 5,Atg 12的表达,以及自噬上游调控分子AMPK,mTOR,ULK1及其磷酸化形式p-AMPK（Thr172）,p-mTOR（Ser2448）,p-ULK1（Ser555）,p-ULK1（Ser757）的蛋白表达情况。结果1.H₂O₂可诱导MEFs细胞衰老通过低剂量的H₂O₂两次诱导的方法,可以有效诱导MEFs细胞衰老,表现为SA-β-gal染色后细胞阳性率升高,且p53,p21蛋白表达升高。同时H₂O₂能够提高细胞总ROS和线粒体ROS水平,提高抗氧化转录因子Nrf2蛋白表达,及Nrf2下游的靶分子HO-1,GCLM和GCLC蛋白表达。2.CHS通过抗氧化应激作用抗H₂O₂诱导的MEFs细胞衰老CHS能够剂量依赖地减轻H₂O₂诱导的MEFs衰老细胞的SA-β-gal染色阳性率,以及p53,p21蛋白的表达。并且CHS能够剂量依赖地下调H₂O₂诱导的MEFs衰老细胞的总ROS和线粒体ROS水平。CHS还可以有效降低H₂O₂诱导的MEFs衰老细胞的抗氧化转录因子Nrf2的表达,及其下游靶分子HO-1,GCLM和GCLC蛋白表达。3.MEFs细胞复制性衰老模型的建立MEFs细胞通过不断传代至15代可明显表现出衰老表型,即SA-β-gal染色后,细胞阳性率升高,且β-gal,p21,p16蛋白表达升高。4.MEFs细胞复制性衰老过程细胞的自噬下调通过不断传代,MEFs细胞随着细胞代龄的增加,细胞自噬水平降低,具体表现为LC3II,Lamp 1,Lamp 2,Beclin 1,Atg 7,Atg 5蛋白表达下降,p62蛋白表达上调,MDC染色减弱,在自噬流通畅的情况下,自噬通量减弱。5.CHS能够减轻MEFs细胞复制性衰老的衰老相关的表型变化CHS能够剂量依赖地减轻MEFs细胞复制性衰老表型,如SA-β-gal染色阳性率以及β-gal,p21,p16蛋白表达水平降低。6.CHS通过上调细胞自噬减轻MEFs复制性衰老的衰老表型CHS在减轻MEFs细胞复制性衰老表型的同时可以提高细胞自噬水平,表现为LC3II蛋白水平升高,p62蛋白表达水平降低,MDC染色增强,在自噬流通畅的情况下,自噬通量增强。7.CHS通过调控AMPK/mTOR/ULK1通路提高自噬抗衰老复制性衰老过程中,15代对照组细胞相比5代对照组细胞p-AMPK（Thr172）以及p-ULK1（Ser555）蛋白水平下调,p-mTOR（Ser2448）和p-ULK1（Ser757）蛋白水平上调。而给予CHS处理后,p-AMPK（Thr172）以及p-ULK1（Ser555）蛋白水平回升,而p-mTOR（Ser2448）和p-ULK1（Ser757）蛋白水平下调。当同时使用了CHS以及AMPK抑制剂Compound C时,CHS对上述调控蛋白的改变被抑制,并且Compound C还抑制了CHS增强自噬及自噬通量,以及抗衰老作用,表现为相比CHS处理组,LC3II蛋白表达下降,p62蛋白表达升高,MDC染色减弱,在自噬流通畅的情况下,自噬通量减弱,并且SA-β-gal染色阳性率以及β-gal,p21,p16蛋白表达水平升高。结论1.CHS可以通过抗氧化应激作用抗H₂O₂诱导的MEFs衰老通过体外氧化应激衰老模型研究,发现太白楤木的单体成分CHS可以有效地降低H₂O₂引起的氧化应激,减轻H₂O₂诱导的细胞衰老,具有很好的抗氧化和抗衰老作用。2.CHS可以通过调控AMPK/mTOR/ULK1通路提高自噬抗MEFs细胞复制性衰老MEFs细胞复制性衰老过程中自噬水平降低,具有自噬激活作用的p-AMPK（Thr172）以及p-ULK1（Ser555）蛋白水平下调,具有自噬抑制作用的p-mTOR（Ser2448）和p-ULK1（Ser757）蛋白水平上调,CHS能够有效地通过上调p-AMPK（Thr172）-p-ULK1（Ser555）,下调p-mTOR（Ser2448）-p-ULK1（Ser757）提高细胞自噬水平,从而达到抗衰老的作用。