论文部分内容阅读
EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是一种双链DNA病毒,与多种肿瘤的发生相关。约有90%以上的健康人群在幼儿时期曾感染EBV,呈持续性潜伏感染状态,且在其体内均可检测到EBV抗体。EBV相关胃癌(EBV associated gastric carcinoma,EBVaGC)约占胃癌总数的3%-8%,临床病理学特征与其他胃癌不同,其发病机制尚未明了。CXCR4属于高度保守的7次跨膜G蛋白偶联受体,已有研究发现CXCR4在多种肿瘤组织中表达升高,可影响多种肿瘤的发生发展过程,如促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、诱导细胞迁移和侵袭以及上皮间质转化等多种生物学活性。CXCR4与病毒感染密切相关,如CXCR4可作为共受体辅助HIV感染并进入宿主细胞。CXCL12可与CXCR4的N端特异性结合,并与CXCR4的第2胞外环相互作用后启动下游信号通路,调控相关肿瘤的发生和发展。目的:明确CXCR4在EBVaGC组织中的表达及其调控机制,并探讨CXCR4在EBVaGC发生发展中的作用以及可能的作用机制,为进一步阐明EBV在EBVaGC发生发展过程中的作用提供理论基础。材料和方法:(1)实时荧光定量PCR检测EBV阳性和EBV阴性胃癌细胞系中CXCR4及相关microRNA的表达。(2)Western blot检测细胞系中CXCR4及相关蛋白的表达;免疫组化检测EBV阳性和EBV阴性胃癌组织中CXCR4表达。(3)亚硫酸氢盐基因组测序法检测CXCR4基因启动子和第1外显子甲基化状态。(4)在EBV阴性胃癌细胞系中分别过表达LMP1或LMP2A,检测microRNA-146a,PI3K/AKT和CXCR4的表达水平。(5)在EBV阳性胃癌细胞系中分别敲减LMP1或LMP2A的表达,检测microRNA-146a,PI3K/AKT和CXCR4表达水平的变化。(6)通过转染microRNA-146a的模拟物和抑制物,提取不同作用条件处理的蛋白,检测CXCR4蛋白表达的变化。(7)PI3K抑制剂LY294002处理细胞,检测CXCR4蛋白表达的变化。(8)采用小干扰RNA靶向沉默CXCR4表达,Western blot检测细胞自噬蛋白LC3B表达的变化,透射电镜和荧光共聚焦显微镜检测自噬小体的形成。(9)流式细胞分析检测靶向沉默CXCR4和自噬激活剂作用对细胞表型的影响。(10)采用小干扰RNA靶向沉默CXCR4表达和自噬激活剂诱导细胞自噬,检测EBV即刻早期基因BZLF1的表达。结果:(1)EBV阳性胃癌细胞系(GT38和GT39)中CXCR4 mRNA和蛋白水平均低于EBV阴性胃癌细胞系(BGC823和SGC7901)(P<0.05);AGS-EBV细胞系中CXCR4 mRNA转录和蛋白表达水平则明显高于AGS细胞系(P<0.05);EBV阳性胃癌细胞系和EBV阴性胃癌细胞系中CXCL12和CXCR7 mRNA转录水平无明显差异;EBVaGC组织中CXCR4表达率较高(与AGS-EBV细胞系的潜伏类型一致)。(2)EBV阳性胃癌细胞系和EBV阴性胃癌细胞系中CXCR4基因启动子和第一外显子均呈现低甲基化状态。(3)EBV阳性胃癌细胞系(GT38和GT39)microRNA-146a的表达水平高于EBV阴性胃癌细胞系(BGC823,SGC7901,AGS)。(4)转染LMP1重组表达质粒可上调EBV阴性胃癌细胞系microRNA-146a的表达,同时下调CXCR4的表达;且干扰EBV阳性胃癌细胞系LMP1表达后可表现出相反的调控模式。(5)microRNA-146a可通过结合CXCR4的3’-UTR区,随着模拟物转染浓度的增加,CXCR4表达水平依次下降,且作用48h的抑制效果明显强于24h(P<0.05)。(6)转染LMP2A重组表达质粒可诱导AKT发生磷酸化,并上调CXCR4的表达;且敲减LMP2A后可表现出相反的调控模式。(7)以不同浓度的PI3K抑制剂LY294002处理AGS-EBV细胞,发现PI3K/AKT通路可以剂量依赖的方式诱导CXCR4的表达。(8)干扰CXCR4蛋白表达,可降低LC3B蛋白表达,同时抑制自噬小体的形成。(9)CXCR4可诱导细胞发生自噬,增加细胞进入G2/M期,促进细胞增殖,同时减少细胞发生凋亡的数量。(10)CXCR4可抑制BZLF1mRNA和蛋白的表达,参与EBV持续性潜伏感染的过程,但细胞自噬并不介导CXCR4-BZLF1-EBV潜伏感染的调控过程。结论:(1)LMP1可通过上调microRNA-146a的表达,抑制靶基因CXCR4的表达。(2)LMP2A可通过PI3K/AKT通路上调CXCR4的表达。(3)LMP1和LMP2A可在不同阶段调控CXCR4的表达,参与EBVaGC的发生和发展过程。