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柑橘溃疡病是由地毯草黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citri,Xac)引起的一种细菌性病害,可影响大部分的商业柑橘栽培品种,造成严重的经济损失。选育优质抗病品种是解决该病害问题的根本途径,其中,利用基因工程将抗病基因导入栽培品种是解决柑橘病害的一条快速而有效的途径。WRKY转录因子和病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins,PRs)在植物抗病信号调控途径中起着重要作用。本研究根据柑橘溃疡病高感品种纽荷尔脐橙(Citrus sinensis(L.)Osbeck)和高抗品种四季橘(Citrus madurensis)受溃疡病侵染后的转录组数据,筛选了在这两个品种中表达差异显著的24个WRKY和4个PR基因进行研究,在此基础上,详细研究了4个WRKY基因和2个PR1基因在柑橘溃疡病抗性中的功能和作用。具体研究结果如下:1.候选基因的克隆和生物信息学分析克隆了Cs WRKY22、Cs WRKY50、Cs WRKY72-1、Cs WRKY72-2、和Cs PR1-1、Cs PR1-2的编码序列,ORF分别为921bp、480bp、1809bp、1767bp、501bp和480bp。用MEGA5.2软件分析其与其他植物同家族蛋白氨基酸序列的亲缘关系,并构建进化树。发现Cs WRKY22与可可WRKY29,Cs WRKY50与枣WRKY50,Cs WRKY72与可可WRKY72,Cs PR1-1与可可PR-1,Cs PR1-2与龙眼PR-1的亲缘关系最近。2.CsWRKY蛋白的亚细胞定位分析构建亚细胞定位载体35S:GFP和35S:Cs WRKY-GFP转化洋葱表皮细胞,荧光显微镜观察显示,对照组在整个细胞中均有表达,融合载体则特异性在细胞核中优势表达,表明Cs WRKY蛋白为核定位蛋白。3.柑橘溃疡病诱导4个Cs WRKY基因的表达接种柑橘溃疡病后,实时荧光定量PCR分析4个Cs WRKY基因在感病品种纽荷尔脐橙和抗病品种四季橘中的表达水平。结果显示,接种溃疡病后,Cs WRKY22在纽荷尔脐橙中表达量高于四季橘,表明其可能参与柑橘的感病反应。Cs WRKY50在四季橘中的表达水平明显高于其在纽荷尔脐橙中的表达水平,表明Cs WRKY50可能参与正调控柑橘的种间抗性,可能是一个抗性基因。Cs WRKY72-1在纽荷尔脐橙和四季橘中的表达水平呈现下降趋势,Cs WRKY72-2在纽荷尔脐橙中的表达下调,在四季橘中表达水平没有明显变化。因此,柑橘溃疡病可能会抑制Cs WRKY72-1和Cs WRKY72-2介导的寄主基础免疫。4.水杨酸与茉莉酸甲酯诱导4个Cs WRKY基因的表达经水杨酸诱导后,4个Cs WRKY基因在四季橘中的表达量下降,在纽荷尔脐橙中其表达水平有轻微上升趋势,但变化不显著。结果表明,水杨酸处理后,在四季橘中4个Cs WRKY基因的表达会受到抑制;而在纽荷尔脐橙中会诱导Cs WRKY基因的表达。经茉莉酸甲酯处理后,4个Cs WRKY基因在两个品种中的表达水平与经水杨酸处理后的结果相似,茉莉酸甲酯会诱导纽荷尔脐橙中4个Cs WRKY基因的表达,但会抑制其在四季橘中的表达。5.超量表达候选基因转基因植株的获得为了评价候选基因在参与柑橘溃疡病抗感性的作用,以p LGNe植物表达载体为骨架,构建了相关植物表达载体,并利用根癌农杆菌介导法将6个基因的超量表达载体分别转化锦橙实生苗上胚轴。GUS组织化学染色法和PCR技术筛选转基因植株,获得:Cs WRKY22转基因植株9株,Cs WRKY50转基因植株5株,Cs WRKY72-1转基因植株10株,Cs WRKY72-2转基因植株5株,Cs PR1-1转基因植株2株,Cs PR1-2转基因植株8株。6.转基因植株溃疡病抗病性评价用柑橘溃疡病病菌接种转基因植株离体叶片,统计病斑面积,分析相关数据,进行转基因植株抗性评价。结果显示,Cs WRKY22转基因植株中出现3株感病性显著增强的植株;Cs WRKY72-1转基因植株中中得到2株抗性显著增强的转基因植株;Cs PR1-1转基因植株中有2株抗病性显著性增强;Cs PR1-2转基因植株中有1株抗病性显著增强的植株。其余转基因植株与对照相比,抗性没有显著变化。7.转基因植株表型观察对转基因植株表型进行分析,结果显示,超量表达Cs WRKY22的转基因植株表现出了与其他转基因植株差异很大的表型。具体表现为植株矮小、叶片窄小变厚、叶片向背面弯曲,其中3株转基因植株表型变化最为显著。结果表明,Cs WRKY22转基因植株感病性与植株的表型紧密相关。