肠缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤是外科常见的重大器官损伤之一,常发生于严重感染、休克、肠梗阻及体外循环心脏手术等病理过程。肠I/R可造成肠黏膜屏障功能障碍、肠粘膜通透性增加、肠道内细菌和内毒素移位进入血液,引发严重的炎症反应和脓毒症,进一步可发展为多器官功能障碍综合征。迄今为止,虽然投入了大量人力物力对肠I/R损伤的发生机制及保护措施进行研究,但由于肠I/R损伤的病理生理学存在的局限性,使其发生机制及防治措施的研究进展缓慢。目前的研究认为肠I/R损伤的发生机制与炎症因子、活性氧释放、细胞凋亡及细胞自噬等因素密切相关。基于此,本研究立足于细胞自噬视角探寻肠I/R损伤的防治新策略,具有较为重要的研究意义。右美托咪定是近年来广泛应用于临床麻醉及ICU的一种镇静镇痛药物。研究表明,右美托咪定除了具有一定抗炎及抗凋亡的作用外,在抗器官I/R损伤中也具有一定的作用。右美托咪定可能是一种预防肠I/R损伤的潜在药物,但是其分子机制尚不清楚。然而目前大部分保护机制的研究集中在其抗炎及抗凋亡作用上,其是否通过调节自噬对肠I/R损伤起到保护作用,尚需进一步研究。基于以上研究背景,本研究拟首先观察右美托咪定对肠I/R损伤的SD大鼠的保护作用,接着在体外观察右美托咪定对炎症环境下肠神经胶质细胞（Enteric glial cells,EGCs）线粒体自噬水平的影响,最后,在EGCs模型及SD大鼠肠I/R模型中探讨右美托咪定通过调控线粒体自噬发挥抗肠I/R损伤作用的可能分子机制。第一部分:右美托咪定改善肠缺血再灌注损伤目的:探讨右美托咪定对肠缺血再灌注的保护作用。方法:将大鼠随机分为四组:对照组（Sham组）、单纯肠I/R模型组（I/R组）、低剂量右美托咪定预处理+肠I/R组（Dex1组）及高剂量右美托咪定预处理+肠I/R组（Dex2组）,每组10只。其中对照组在麻醉后切开腹腔但不夹闭肠系膜上动脉,其余三组大鼠在麻醉后通过夹闭大鼠肠系膜上动脉缺血60min,再灌注120min建立肠I/R损伤模型。在夹闭肠系膜上动脉前,对Dex1组大鼠经尾静脉以2.5μg/kg/h速率持续泵入右美托咪定1h进行预处理,对Dex2组大鼠经尾静脉以5.0μg/kg/h速率持续泵入右美托咪定1h进行预处理,而I/R组大鼠则经尾静脉以1.5m L/h速率持续泵入生理盐水1h。实验结束后,收集肠组织,常规方法检测肠组织湿/干（W/D）比值,HE染色观察肠粘膜病理改变,按Chiu’s评分法评估其损伤程度。测定大鼠肠道组织中丙二醛(（Malondialdehyde,MDA）水平和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性评估氧化应激损伤情况。利用ELISA检测各组大鼠血清中TNF-α和IL-6的表达水平。通过免疫组化法和蛋白印迹法评估各组大鼠肠组织胶原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）和S-100β的表达。通过TUNEL检测各组大鼠肠组织细胞凋亡情况。结果:与Sham组相比,I/R组大鼠病理损伤严重,Chiu’s评分显著增加（P＜0.05）,肠组织W/D显著升高（P＜0.05）,肠粘膜组织中MDA浓度升高（P＜0.05）,肠粘膜组织中SOD活性水平显著降低（P＜0.05）,肠管组织的EGCs中GFAP及S-100β的阳性表达增加,GFAP及S-100β蛋白表达水平均明显升高（P＜0.05）以及细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）;与I/R组相比,Dex1和Dex2处理组大鼠病理损伤均得到改善,Chiu’s评分显著降低（P＜0.05）,肠组织W/D显著降低（P＜0.05）,肠粘膜组织中MDA浓度降低（P＜0.05）,肠粘膜组织中总SOD活性水平显著升高（P＜0.05）,肠管组织的EGCs中GFAP及S-100β的阳性表达降低,GFAP及S-100β蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05）以及细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）;两种浓度右美托咪定均明显改善肠I/R损伤,且Dex2组的保护作用好于Dex1组。结论:右美托咪定可以抑制肠管氧化应激、炎症,减少细胞凋亡,改善肠I/R损伤。第二部分:右美托咪定通过促进线粒体自噬减轻炎症环境下EGCs线粒体损伤及凋亡目的:探讨右美托咪定对炎症环境下EGCs线粒体自噬的影响。方法:体外通过对EGCs用TNF-α（50ng/m L）和IFN-γ（100ng/m L）刺激40h,构建炎症细胞模型。分为Untreated组、Stimulated组、Dex处理组、线粒体自噬抑制剂（3-MA）处理组及阳性对照CCCP组,其中Untreated组为对照组。利用流式细胞术、hoechest33342染色及线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）检测细胞凋亡水平。通过蛋白印迹法检测SIRT3、PINK1、p53、LC3-II/I、p62、Atg5、Bax、Bcl-2、Caspase-3和Cleaved-caspase-3的表达水平评估线粒体自噬及细胞凋亡。通过透射电镜观察EGCs超微结构变化。结果:与Untreated组相比,Stimulated组EGCs细胞早期凋亡率显著增加（P＜0.05）,MMP显著减少（P＜0.05）,Hoechst33342染色出现核浓缩、偏移以及细胞数量减少。透射电镜结果显示:Stimulated组EGCs中可见少量受损线粒体。而蛋白印迹结果则显示:Stimulated组EGCs细胞LC3-II/LC3-I比值降低（P＜0.05）、p62表达升高（P＜0.05）、Atg5表达降低（P＜0.05）、Bax表达升高（P＜0.05）、Bcl-2表达降低（P＜0.05）、Caspase-3表达降低（P＜0.05）、Cleaved Caspase-3表达升高（P＜0.05）;与Stimulated组相比,Dex组EGCs细胞早期凋亡率显著降低（P＜0.05）,MMP显著升高（P＜0.05）,Hoechst33342染色凋亡特征性表现减少。透射电镜结果显示:Dex组EGCs中可见明显肿胀线粒体、线粒体溶解,气球样变,出现自噬小体。蛋白印迹结果则显示:Dex组EGCs细胞LC3-II/LC3-I比值升高（P＜0.05）、p62表达降低（P＜0.05）、Atg5表达升高（P＜0.05）、Bax表达降低（P＜0.05）、Bcl-2表达升高（P＜0.05）、Caspase-3表达升高（P＜0.05）、Cleaved Caspase-3表达降低（P＜0.05）;表明右美托咪定能够减轻炎症环境下EGCs线粒体损伤及凋亡。与Dex组相比,自噬抑制剂3-MA处理组EGCs细胞早期凋亡率显著增加（P＜0.05）,MMP显著减少（P＜0.05）,Hoechst33342染色出现细胞数量减少以及凋亡小体。透射电镜结果显示:3-MA组EGCs中未见自噬小体。而蛋白印迹结果则显示:3-MA组EGCs细胞LC3-II/LC3-I比值降低（P＜0.05）、p62表达升高（P＜0.05）、Atg5表达降低（P＜0.05）、Bax表达升高（P＜0.05）、Bcl-2表达降低（P＜0.05）、Caspase-3表达降低（P＜0.05）、Cleaved Caspase-3表达升高（P＜0.05）。结论:右美托咪定可以调控线粒体自噬相关蛋白的表达,促进线粒体自噬减轻炎症环境下EGCs线粒体损伤及凋亡。第三部分:右美托咪定通过SIRT3介导的PINK1/HDAC3/p53通路促进线粒体自噬减轻炎症环境下EGCs线粒体损伤及凋亡目的:探讨右美托咪定通过SIRT3介导的PINK1/HDAC3/p53通路促进线粒体自噬减轻炎症环境下EGCs线粒体损伤及凋亡的调控机制。方法:体外通过对EGCs用TNF-α（50ng/m L）和IFN-γ（100ng/m L）刺激40h,构建炎症细胞模型。第一步将EGCs细胞分为Stimulated组、Dex处理组、SIRT3抑制剂（3-TYP）处理组,通过流式细胞术及MMP检测细胞凋亡水平,应用蛋白印迹法检测自噬相关蛋白（LC3-II/I、Atg5和p62）和凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、caspase-3和Cleaved-caspase-3）的表达。观察SIRT3在右美托咪定促进线粒体自噬减轻炎症环境下EGCs线粒体损伤和凋亡过程中的作用。第二步则将EGCs细胞分为对照组,sh-NC处理组、sh-PINK1处理组、HDAC3抑制剂（RGFP966）处理组。通过免疫共沉淀验证PINK1、HDAC3与p53之间相互作用。通过对PINK1基因沉默及使用HDAC3抑制剂进行干预,应用蛋白印迹法检测PINK1、HDAC3、p-HDAC3及p53的表达水平,从而验证PINK1、HDAC3与p53之间的调控关系。最后,通过对PINK1基因沉默及使用HDAC3及p53抑制剂进行干预,通过流式细胞术及MMP检测细胞凋亡水平,应用蛋白印迹法检测自噬相关蛋白（LC3-II/I、Atg5和p62）和凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、caspase-3和Cleaved-caspase-3）的表达。论证SIRT3介导的PINK1/HDAC3/p53通路在右美托咪定促进线粒体自噬减轻炎症环境下EGCs线粒体损伤和凋亡过程中的作用。结果:（1）与Stimulated组相比,Dex组EGCs细胞中流式细胞术、MMP、透射电镜及蛋白印迹结果变化趋势与论文第二部分一致。与Dex组相比,SIRT3抑制剂3-TYP处理组EGCs细胞早期凋亡率显著增加（P＜0.05）,MMP显著减少（P＜0.05）。透射电镜结果显示:3-TYP组EGCs中未见自噬小体。而蛋白印迹结果则显示:3-TYP组EGCs细胞中SIRT3表达显著降低（P＜0.05）、PINK1表达显著降低（P＜0.05）、p53表达显著升高（P＜0.05）、LC3-II/LC3-I比值显著降低（P＜0.05）、p62表达升高（P＜0.05）、Atg5表达降低（P＜0.05）、Bax表达升高（P＜0.05）、Bcl-2表达降低（P＜0.05）、Caspase-3表达降低（P＜0.05）、Cleaved Caspase-3表达升高（P＜0.05）;提示右美托咪定通过调节SIRT3和PINK1的表达来调节线粒体自噬,抑制炎症环境下EGCs的线粒体损伤和凋亡。（2）免疫共沉淀结果显示免疫复合物中存在PINK1与HDAC3蛋白及HDAC3蛋白与p53的相互结合。与空载对照组相比,sh-PINK1组PINK1和p-HDAC3表达水平显著降低（P＜0.05）,而p53的表达显著增加（P＜0.05）,而且沉默PINK1能够使HDAC3与p53结合减弱。与sh-PINK1组相比,用sh-PINK1和HDAC3抑制剂RGFP966共同处理的EGCs中HDAC3的表达显著降低（P＜0.05）,而p53的表达则显著升高（P＜0.05）。与对照组相比,RGFP966组HDAC3的表达显著降低（P＜0.05）,p53的表达显著升高（P＜0.05）。以上结果表明,PINK1、HDAC3及p53相互结合,PINK1通过促进HDAC3的磷酸化来降低p53的表达。（3）与sh-NC组相比,sh-PINK1组EGCs早期凋亡率、MMP、p53、LC3-I、LC3-II、p62、Atg5、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白的表达以及透射电镜结果差异均无统计学意义。与sh-NC组相比,sh-PINK1组EGCs中PINK表达显著降低（P＜0.05）。与sh-PINK1组相比,PFT-α组EGCs早期凋亡率显著下降（P＜0.05）,MMP显著升高（P＜0.05）,PINK1表达降低（P＜0.05）,p53表达降低（P＜0.05）,LC3-II/LC3-I比值升高（P＜0.05）,p62表达降低（P＜0.05）,Atg5表达升高（P＜0.05）,Bax表达降低（P＜0.05）,Bcl-2表达升高（P＜0.05）,Caspase-3表达升高（P＜0.05）,Cleaved Caspase-3表达降低（P＜0.05）。透射电镜结果显示:p53抑制剂PFT-α组线粒体明显存在形态学异常,出现自噬小体。表明PINK1通过抑制p53进而减轻炎症环境下EGCs线粒体损伤及凋亡。（4）与Stimulated组相比,Dex组EGCs细胞中流式细胞术、MMP、Hoechst33342染色、透射电镜及蛋白印迹结果变化趋势与论文第二部分一致。与Dex组相比,HDAC3抑制剂RGFP966处理组EGCs细胞早期凋亡率显著增加（P＜0.05）,MMP显著减少（P＜0.05）。Hoechst33342染色结果显示:细胞数量减少、核浓缩及偏移。透射电镜结果显示:RGFP966组EGCs中偶见受损线粒体,未见自噬小体。而蛋白印迹结果则显示:RGFP966组EGCs细胞中SIRT3表达稍降低（P＞0.05）、PINK1表达稍降低（P＞0.05）、p53表达升高（P＜0.05）、LC3-II/LC3-I比值降低（P＜0.05）、p62表达升高（P＜0.05）、Atg5表达降低（P＜0.05）、Bax表达升高（P＜0.05）、Bcl-2表达降低（P＜0.05）、HDAC3表达降低（P＜0.05）、p-HDAC3表达降低（P＜0.05）、Caspase-3表达降低（P＜0.05）、Cleaved Caspase-3表达升高（P＜0.05）;提示,右美托咪定通过SIRT3介导的PINK1/HDAC3/p53通路减轻炎症环境下EGCs线粒体损伤及凋亡。结论:右美托咪定通过SIRT3介导的PINK1/HDAC3/p53通路调控线粒体自噬相关蛋白的表达,促进线粒体自噬减轻炎症环境下EGCs线粒体损伤和凋亡。第四部分:右美托咪定通过SIRT3介导的PINK1/HDAC3/p53通路促进线粒体自噬减轻肠缺血再灌注损伤目的:探讨右美托咪定通过SIRT3介导的PINK1/HDAC3/p53通路促进线粒体自噬减轻肠缺血再灌注损伤的调控机制。方法:参照本文第一部分构建大鼠肠I/R损伤模型,将大鼠分为对照组（Sham组）、单纯肠I/R损伤组（I/R组）、右美托咪定预处理+肠I/R损伤组（Dex组）及RGFP966+右美托咪定预处理+肠I/R损伤组（RGFP966组）4组。常规方法检测肠W/D,光镜下观察各组大鼠肠粘膜病理改变,按Chiu’s评分法评估其损伤程度。测定大鼠肠道组织中MDA水平和SOD活性评估氧化应激损伤情况。利用ELISA检测各组大鼠血清中TNF-α和IL-6的表达水平。通过免疫组化法和蛋白印迹法评估各组大鼠肠组织GFAP和S-100β的表达。通过TUNEL检测各组大鼠肠组织凋亡情况。通过蛋白印迹法检测SIRT3、PINK1、p53、LC3-II/I、p62、Atg5、Bax、Bcl-2、Caspase-3和Cleaved-caspase-3的表达水平。结果:与Sham组相比,I/R组大鼠病理损伤严重,Chiu’s评分显著增加（P＜0.05）,肠组织W/D显著升高（P＜0.05）,肠粘膜组织中MDA浓度升高（P＜0.05）,肠粘膜组织中总SOD活性水平显著降低（P＜0.05）,细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）;与Sham组相比,I/R组大鼠肠道组织中表达显著升高的有GFAP、S-100β、Bax、p53、HDAC3、Cleaved-Caspase-3及p62蛋白（P＜0.05）。表达显著降低的有SIRT3、PINK1、Bcl-2、p-HDAC3、Caspase-3、Atg5蛋白以及LC3II/LC3I（P＜0.05）;与I/R组相比,Dex处理组大鼠病理损伤得到改善,Chiu’s评分显著降低（P＜0.05）,肠组织W/D显著降低（P＜0.05）,肠粘膜组织中MDA浓度降低（P＜0.05）,肠粘膜组织中总SOD活性水平显著升高（P＜0.05）,细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）;与I/R组相比,Dex处理组大鼠肠管组织中GFAP、S-100β、Bax、p53、HDAC3、Cleaved-Caspase-3及p62蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05）。与I/R组比较,Dex组大鼠肠管组织中SIRT3、PINK1、Bcl-2、p-HDAC3、Caspase-3、Atg5蛋白表达以及LC3II/LC3I显著升高（P＜0.05）;与Dex组比较,RGFP966组大鼠病理损伤严重,Chiu’s评分显著增加（P＜0.05）,肠组织W/D显著升高（P＜0.05）,肠粘膜组织中MDA浓度升高（P＜0.05）,肠粘膜组织中总SOD活性水平显著降低（P＜0.05）,细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）;与Dex组比较,RGFP966组大鼠肠道组织中Bcl-2、HDAC3、p-HDAC3、Caspase-3、Atg5蛋白表达以及LC3II/LC3I显著降低（P＜0.05）;与Dex组比较,RGFP966组大鼠肠管组织中SIRT3蛋白表达轻微升高,PINK1蛋白表达轻微下降,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论:右美托咪定可以通过SIRT3介导的PINK1/HDAC3/p53通路调控线粒体自噬相关蛋白的表达,促进线粒体自噬减轻缺血再灌注损伤。