副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种广泛存在于水产养殖水域的革兰氏阴性变形杆菌,是引起养殖动物病害的重要病原菌,且是遍布世界的食源性致病菌,严重威胁人类健康。近年来,副溶血弧菌耐药问题日趋严重,对于水环境中副溶血弧菌耐药性产生原因的研究,目前多集中于抗生素长期大量、不规范使用,而对水环境中环境因子与副溶血弧菌耐药性关系的研究较少。养殖水环境中氮磷营养盐大量富集不但导致水体富营养化,引起养殖生态环境的恶化,严重阻碍水产养殖业的持续、健康发展,已有的研究证实氮磷营养盐也会导致细菌耐药性的产生。氮磷营养盐对副溶血弧菌耐药性的影响及其作用机制,目前尚不清楚,为了解氮磷营养盐与副溶血弧菌生长、耐药水平、耐药基因的形成和维持以及生物膜形成能力的相关性,本论文进行了以下研究:1. 养殖环境中副溶血弧菌的耐药性和毒力基因研究从山东日照、青岛、烟台和潍坊4个地区养殖场对虾养殖池收集分离副溶血弧菌,采用Kirby-Bauer纸片法检测其对12种抗生素的耐药性,用PCR方法检测其携带毒力基因tdh和trh的情况。从对虾养殖池共分离副溶血弧菌50株,药敏实验结果显示:副溶血弧菌对庆大霉素、硫酸新霉素和氨苄西林的耐药情况最为严重,耐药率分别98%、90%和86%;对氟苯尼考、氯霉素、头孢他啶等敏感性较高,耐药率分别为10%、10%和20%;此外,88%的菌株具有多重耐药性。毒力基因检测结果显示,所有菌株均不携带tdh基因,4%的菌株表现为trh阳性。本研究表明,对虾养殖水环境中的副溶血弧菌对抗生素的耐药性较为严重。2. 不同氮磷营养盐对副溶血弧菌生长及维持的影响为了解水环境中氮磷营养盐对副溶血弧菌生长的影响,共设置四组实验,一个空白对照组和氮磷低剂量组(TN:1.5 mg/L,TP:0.15 mg/L)、中剂量组(TN:4.5mg/L,TP:0.45 mg/L)和高剂量组(TN:7.5 mg/L,TP:0.75 mg/L)三个实验组,每组准备2个10L的白色透明的整理箱,清洗干净、消毒,分别加入6L灭菌海水和10~5cfu/ml副溶血弧菌标准菌株ATCC17802,实验组分别加入不同剂量氮磷营养盐,每隔5d取样分离鉴定副溶血弧菌并计算菌落浓度。结果表明,菌株数量随着时间推移大致呈下降趋势。空白组2号箱在第5天菌落浓度下降至最低(50 cfu/ml),1号箱第10d下降至最低(70 cfu/ml);低中高三个剂量组的菌株维持相对空白组较长。中剂量组5号箱(1.1×10~2cfu/ml)跟6号箱(1×10~2cfu/ml)菌落浓度均在第15d下降至最低;低剂量组的3号箱(50 cfu/ml)第20d下降至最低,4号箱则在第15d(60 cfu/ml)菌落浓度下降至最低;高剂量组7号箱(60 cfu/ml)与8号箱(40 cfu/ml)均在第20d下降至最低,直至第25天,所有箱内均未分离得到副溶血弧菌。整个实验周期共分离得到399株副溶血弧菌。本研究表明添加不同剂量氮磷营养盐的对副溶血弧菌的生长及维持均有促进作用。3. 不同浓度氮磷营养盐对副溶血弧菌耐药表型的影响采用K-B药敏纸片法对第二章分离的399株副溶血弧菌进行盐酸多西环素、氟苯尼考、复方新诺明、恩诺沙星和头孢他啶5种抗生素的药物敏感性实验。结果表明,不同剂量氮磷营养盐对头孢他啶耐药性影响最大且与添加剂量成正比,在添加氮磷后的第5d,低(TN:1.5 mg/L,TP:0.15 mg/L)、中(TN:4.5 mg/L,TP:0.45mg/L)、高(TN:7.5 mg/L,TP:0.75 mg/L)剂量组均开始出现耐药菌,第10d时,中、高剂量组耐药率分别上升到36.7%和40%,低剂量组耐药率下降至7.1%。第15d仅在高剂量组分离得到头孢他啶耐药菌,耐药率为15%。氮磷营养盐的添加使大量头孢他啶敏感株转变为中介株,中介率达45%;对恩诺沙星耐药性影响也与添加剂量成正比,低剂量组未获得耐药菌,中剂量组在第10d天出现耐药菌,第15d耐药率最高达4.8%。高剂量组第10d出现耐药菌,第15d耐药率最高达10%。氮磷营养盐的添加明显降低菌株恩诺沙星敏感性,低、中、高实验组中介率20%明显高于空白组10%;对盐酸多西环素耐药有较大影响,总体来看添加剂量越高盐酸多西环素耐药现象越明显。低剂量组第5d最先分离得到耐药菌,之后耐药率呈下降趋势,第10d下降至最低3.6%。中剂量组仅在第10d天出现3.3%耐药率。高剂量组第10d开始出现耐药菌,第20d时耐药率升至最高达20%。氮磷的添加明显降低菌株盐酸多西环素敏感性,低、中、高三个实验组中介率6.7%明显高于空白组1.8%;对氟苯尼考耐药性影响较小,仅低剂量组与中剂量组出现耐药菌,且氟苯尼考中介率明显低于头孢他啶、盐酸多西环素以及恩诺沙星中介率;对复方新诺明耐药性无影响,未获得耐药菌;表明水环境中添加氮磷营养盐可增强副溶血弧菌的耐药性,诱发副溶血弧菌对盐酸多西环素、氟苯尼考、恩诺沙星、头孢他啶产生不同程度的耐药,且头孢他啶与恩诺沙星耐药率与氮磷添加剂量成正比,对复方新诺明的耐药性变化无影响。研究提示我们在水产养殖过程中,应严格控制水环境中氮磷营养盐含量,降低副溶血弧菌耐药性产生的风险。4. 氮磷营养盐诱导副溶血弧菌产生耐药性的机制采用PCR技术对副溶血弧菌标准菌株ATCC17802及氮磷诱导后的副溶血弧菌进行四环素类、喹诺酮类、酰胺醇类以及β-内酰胺酶类耐药基因检测,采用结晶紫染色法检测氮磷诱导后副溶血弧菌生物膜的生成情况。结果显示,所有菌株四环素类耐药基因、喹诺酮类耐药基因、酰胺醇类耐药基因以及β-内酰胺酶类bla CTX-M、bla SHV、bla OXA阳性率均为0%,所有菌株仅携带β-内酰胺酶类bla TEM基因,且阳性率为100%;实验组副溶血弧菌生物膜的发育明显高于空白对照组,所有抗生素耐药菌株的生物膜平均生成量均高于敏感菌株,表明氮磷营养盐能促进副溶血弧菌生物膜发育。盐酸多西环素、氟苯尼考、恩诺沙星耐药菌株均不携带相关耐药基因,但生物膜生成量均高于敏感株,表明氮磷诱导副溶血弧菌形成生物膜是产生耐药性的重要机制。初始菌株对头孢他啶敏感,经氮磷诱导后出现大量耐药菌,推测氮磷诱导副溶血弧菌产生头孢他啶耐药性除形成生物膜外,可能还与β-内酰胺酶基因bla TEM表达有关。对虾养殖池内副溶血弧菌耐药现象严重,水环境中氮磷营养盐可通过促进副溶血弧菌生物膜形成,或可能调节耐药基因表达等机制诱导副溶血弧菌产生耐药性,并对副溶血弧菌的生长及维持起促进作用,表明,在养殖中应严格控制水环境中氮磷浓度,控制副溶血弧菌生长及其耐药性的产生。