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端粒酶是核糖核蛋白复合体,其丰要功能是增加染色体末端端粒的不断重复以维护它的稳定性和细胞的恶性增殖。端粒酶包括两个基木成分,端粒酶RNA模板hTR和催化亚单位hTERT(端粒酶逆转录酶)。hTERT是端粒酶的最重要成分,它能催化全酶的活性,其启动子是这一功能的核心,因为它仪在有端粒酶活性的肿瘤细胞内表达,因此hTERT可作为一个较为理想的肿瘤治疗靶点,以此为突破点,自杀基因可达到靶向治疗肝癌的目的。目的:构建去唾液酸糖蛋白(AF)-pGL3-人端粒酶逆转录酶(hTERT)肩动子-胸甘激酶(TK),即AF-pGL3-hTERT-TK复合物,通过脂质体转染方法将其转染入肿瘤细胞后,观察其对肝癌细胞株HepG2生长及凋亡的影响。方法:1.细胞培养;2.通过酶切产物的连接,构建荧光报告质粒组和治疗质粒组;3.制备AF标记的脂质体,通过脂质体转染法转入人肝癌细胞HeptG2和正常肝细胞L-02;4.用荧光显微镜,液闪计数仪观察荧光报告质粒转染细胞后的荧光,以及hTERT启动子在细胞中驱动荧光基因表达的强弱;5.用TUNEL方法,流式细胞仪技术观察治疗质粒转染细胞后对细胞牛长,凋亡及旁观者效应的情况;6.Westem blotting技术观察转染AF-pGL3-hTERT-TK后肝癌细胞周期蛋白调控因子的表达情况。结果:1.成功构建荧光报告质粒组:pGL3-basic(阴性对照)、pGL3-control(阳性对照)、pGL3-hTERT-Luc+;治疗质粒组:pGL3-basic-TK(阴性对照)、pGL3-control-TK(阳性对照)、pGL3-hTERT-TK。2.使用Luciferase Assay检测系统发现,pGL3-hTERT-Luc+转染HepG2细胞后的相对活性是pGL3-control的60%,但明显高于阴性对照pGL3-basic;但是pGL3-hTERT-Luc+转染端粒酶阴性的L-02细胞后其荧光活性仪为pGL3-Control的13%,说明在肝癌细胞中hTERT启动子有强大的转录活性;相比之下,pGL3-hTERT-Luc+质粒在端粒酶阴性的正常肝细胞L-02中荧光素酶的表达很弱。3.在肝癌细胞中TK基因可以被hTERT启动子驱动高效的表达,几乎不影响正常肝细胞L-02的生长;AF通过识别ASGPR受体结合到HepG2细胞表面,其携带的TK基因更易进入肝癌细胞,同时增强自杀基因TK的表达效果,在旁观者效应机制的参与下,肝癌细胞总的凋亡率达85%±3%,而正常肝细胞则仪为16%±2%;其机制可能是通过细胞周期因子cyclinD1、Cdk2和p21的调控来抑制月十癌细胞的增殖。结论:AF-pGL3-hTERT-TK可以靶向攻击肝癌细胞,对正常肝细胞几乎无影响,其基因传递系统具有靶向治疗肝癌的潜力。