论文部分内容阅读
[目的]构建和鉴定恒河猴PD-L1Ig和CD40L胞外区基因重组腺病毒载体。鉴定PD-L1Ig和CD40L胞外区基因重组腺病毒载体在恒河猴未成熟树突状细胞(immature dendritic cell, imDC)中的表达。[方法]1.恒河猴PD-L1Ig和CD40L胞外区基因的重组腺病毒载体的构建、鉴定和包装。查询GeneBank中恒河猴PD-L1和IgGlFc基因序列并基因合成PD-L1Ig目的基因序列,然后PCR扩增PD-L11g目的基因。将PD-L1Ig基因双酶切产物与线性化的GV282载体连接,然后转化感受态大肠杆菌、氨苄霉素(Amp)筛选转化组菌落、PCR鉴定阳性转化子得到重组质粒载体pCMV-3FLAG-IRES-EGFP-PD-L1Ig并对其测序。将pGEM-T-efCD40L质粒PCR后的双酶切产物与线性化重组质粒载体pCMV-3FLAG-IRES-EGFP-PD-L1Ig连接,通过转化感受态大肠杆菌、氨苄霉素(Amp)筛选转化组菌落、PCR鉴定阳性转化子重组穿梭载体pShuttleCMV-efCD40L-3FLAG-IRES-EGFP-PD-L1Ig并对其测序。重组穿梭载体转染293T细胞,并Western Blot鉴定目的蛋白的表达。应用腺病毒AdMax包装系统法将HEK293细胞和重组载体包装成重组腺病毒,并用终点稀释法检测重组腺病毒滴度。2.分离培养恒河猴imDC,重组腺病毒转染imDC, Western Blot鉴定PD-L1Ig和CD40L胞外区基因在恒河猴imDC的表达。用猴淋巴细胞分离液提取恒河猴骨髓血中的单个核细胞,免疫磁珠法分选单个核细胞中的CD34+阳性细胞,应用细胞因子GM-CSF、IL-4诱导培养其分化为imDC。确定重组腺病毒转染imDC的最佳转染MOI值。转染48小时后提取蛋白并通过Western Blot分别鉴定PD-L1Ig和CD40L基因在imDC中蛋白的表达。[结果]重组质粒载体pCMV-3FLAG-IRES-EGFP-PD-L1Ig序列测序结果正确。重组穿梭载体pShuttleCMV-efCD40L-3FLAG-IRES-EGFP-PD-L1Ig序列测序结果正确。重组穿梭载体转染293T细胞后Western Blot检测目的融合蛋白,23kD处出现特异性条带。重组腺病毒滴度为1×10-11 PFU/ml。重组腺病毒转染恒河猴imDC, Western Blot检测PD-L1Ig,33kD处出现特异性条带,Western Blot检测CD40L胞外区,可见29kD处出现特异性条带。[结论]成功构建pCMV-3FLAG-IRES-EGFP-PD-L1Ig重组质粒载体。成功构建重组穿梭载体pShuttleCMV-efCD40L-3FLAG-IRES-EGFP-PD-L1Ig。应用腺病毒AdMax包装系统法成功获得高滴度重组腺病毒。PD-L1Ig和CD40L胞外段基因可以在恒河猴imDC中稳定的表达。[展望]重组腺病毒成功转染恒河猴imDC且稳定表达,为进一步研究在进行恒河猴肝移植体内实验中PD-L1Ig和CD40L胞外区基因诱导肝移植免疫耐受提供了理论和实验基础。