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禽流感病毒(Avianinfluenzavirus, AIV).禽白血病病毒(Avianleukosisvirus,ALV)、禽传染性支气管炎病病毒(Infectiousbronchitisvirus, IBV)、鸡传染性法氏囊病病毒(Infectiousbursaldiseasevirus, IBDV)是四种严重危害家禽养殖业的禽类传染病重要病原。建立AIV. ALV. IBV和IBDV特异灵敏的检测技术,对于早期发现传染源,及尽早采取措施消除传染源,切断疾病传播途径,降低疾病危害具有重要意义。本研究根据ALV病毒M基因的保守序列,利用Primer Premier 5.0设计ALV简并引物,参照文献选择AIV、IBV、IBDV的引物,以从AIV、ALV、IBV和IBDV的细胞培养液中抽提的病毒RNA作为模板,分别RT-PCR扩增了他们各自特异的基因片段,成功构建阳性对照质粒pMD-18T-AIV、pMD-18T-ALV、pMD-18T-IBV和pMD-18T-IBDV。通过退火温度、引物比例、引物浓度、dNTP浓度、Mg2+浓度和PCR buffer浓度等条件的优化,确定AIV、ALV、IBV和IBD V四重PCR最佳反应条件为：AIV与IBV引物浓度为0.125μM, ALV与IBDV引物浓度为0.1875μM, PCR Buffe浓度为1.5×, Taq DNA聚合酶用量为0.075U/μL, Mg2+浓度为2.5mM, dNTP浓度为200μM。最佳退火温度为52℃。以10倍系列稀释的pMD-18T-AIV、pMD-18T-ALV、pMD-18T-IBV、作为模板扩增结果显示,四重PCR检测ApMD-18T-IBDV的灵敏度分别为102拷贝、103拷贝、102拷贝、103拷贝。以10倍系列稀释的AIV、IV、ALV、IBV和IBDV和IBDV作为模板扩增结果显示,四重RT-PCR检测AIV、ALV、IBVALV、IBV和IBDV的灵敏度分别为四重PCR扩增0.0001TCID50、100fg、0.00001TCID50和0.001TCID50。或其中2、3和4种质粒组合时,均可相应产生1、2、3或4条特异性条带；而检pMD-18T-AIV.pMD-18T-ALV.pMD-18T-IBV和pMD-18T-IBDV测其它几种禽类病毒基因克隆质粒时,均无特异性条APV、EDSV、MDV和NDV带产生。四重扩增RT-PCR核酸或其中2、3和4种核酸AIV.ALV、IBV和IBDV组合时,也均相应产生1、2、3和4条特异性条带；而检测其它几种禽类病毒APV、和NDV核酸时,均无特异性条带产生。表明本研究建立的EDSV、MDV四重RT-PCR具有高度特异性,一次扩增可检测可以检测出AIV、ALV、 IBV和IBDV中任1种,或其中2、3和4种病毒的混合。AIV、ALV、 IBV和IBDV将细胞培养的单独或其中2、3或4种病毒混合添加AIV、ALV、IBV、IBDV到经单一PCR检测阴性的禽类粪便制备人工阳性样品,四重RT-PCR扩增结果显示,该方法可准确检测出四种病毒中之1种,或其中2、3和4种病毒混合的人工阳性样品。表明本研究建立的AIV、ALV、IBV和IBDV四重RT-PCR不仅可以用于实验室培养病毒的检测,也适用于禽类组织和排泄物材料等临床样品中AIV、ALV、IBV和IBDV的检测。在武汉市虎泉集贸市场采集鸡、鸭和鸽子粪便样品各10份,在湖北省武汉市、大冶市采集六科7属9种野生鸟类67只,分别提取病毒RNA四重RT-PCR检测,结果在鸡、鸭和鸽子粪便样品中未检测到AIV、ALV、IBV和BDV,67只野生鸟类组织样品中,自大冶市采集的6只斑鸠及武汉市采集的1只领雀嘴鹎IBDV检测阳性,AIV、ALV和IBV检测阴性。检测结果为IBDV的分子流行病学及分子溯源提供了依据。