草莓是一年中上市最早的浆果，它营养丰富，产量高，用途广泛，种植范围遍及地球的各条温带。但用做栽培的草莓苗都是无性繁殖，并随着病毒逐年扩散，严重降低了草莓的产量和品质。根据Beker(1956)报道草莓被一种隐性病毒侵染，产量可下降21～35％，两种以上病毒复合侵染，产量会下降43～59％，而且果实少，品质差，酸度增加，含糖量降低。因此，防治草莓病毒病是提高草莓产量和品质的一项重要措施。 目前，防治草莓病毒病的措施主要有两种：1.是利用组织培养技术脱掉现有草莓品种的病毒，培育无病毒种苗，利用无病毒苗进行草莓生产。2.利用抗病毒基因对现有的优良品种进行遗传转化，培育抗病毒转基因新品种(系)。 本研究以草莓主栽品种“戈雷拉”和“森嘎拉”进行了病毒种类和感染程度的鉴定，同时对草莓脱毒技术和培育无毒苗的途径进行了探讨。并通过基因工程手段，采用基因联合导入策略，将天花粉蛋白基因(TCS)和大麦核糖体失活蛋白基因(RIP)构建在同一植物表达载体pABTR上，采用农杆菌介导法导入草莓优良品种中。较系统地探讨了影响草莓遗传转化的主要因素，建立了高效的草莓植株再生体系和遗传转化体系，获得了转基因阳性植株。本研究为草莓抗病毒分子育种奠定了重要基础。对于提高草莓优良品种抗病性及保证其高产稳产等方面均具有十分重要的意义。 1.黑龙江省主要草莓品种病毒种类和感病程度 通过鉴定发现，主栽品种均己受到病毒侵染，圆球、丽红和戈雷拉的侵染率已达到100％，除森嘎拉和Sin(72)目前只被一种班驳病毒侵染以外，鸡心和圆球已被四种病毒侵染，戈雷拉、维斯尔和丽红也被两种或三种病毒侵染。从病毒种类上看，侵染率最高的是班驳病毒(SMOV)，其次为皱缩病毒(SCrV)和轻型黄边病毒(SMYEY)，最低的是镶脉病毒(SVBV)。 2.草莓脱毒技术 2.1培养基的筛选 茎尖培养： 生长培养基为：MS+1mgBA/L+0.2mgIAA/L分化培养基为：MS+2mgBA/L+0.1mgIAA/L；生根培养基为：MS+0.2mgIBA/L。 花药培养： 愈伤组织诱导培养基为：LS+2mgBA/L+0.5mgNAA/L，诱导率可达92.8％。 不定芽诱导培养基为：LS+2mgBA/L+0.3mgIAA/L，诱导率达10％。 幼叶培养： 愈伤组织诱导培养基为：LS+2mgBA/L+0.5-2mg2.4D/L，诱导率可达100％；不定芽诱导培养基为：LS+2mgBA/L+0.5mg2.4D/L，诱导率达70％。 2.2脱毒效果比较： 通过茎尖培养可以脱掉病毒，但茎尖长度小于0.5mm时，才有20％以上的脱毒效果。且茎尖越短，脱毒效果越好，愈伤组织途径中花药培养脱毒效果最好，可达100％脱毒，可以省去病毒鉴定工作。此外，连续切取茎尖、药剂处理、加热处理(38℃±1℃)，幼叶培养均有一定程度的脱毒效果，但都不能达到100％脱毒。 3.抗病毒基因对草莓的遗传转化 3.1植物表达载体的构建 (1)本研究共构建了5个载体，其中包括2个中间克隆载体pMTCS、pUR01和2个中间表达载体pBTC、pARIP，以及1个双价抗病毒基因植物表达载体pABTR。 (2)将3个表达载体中目的基因的启动子均改造成双35S启动子，以增强目的基因在双子叶植物中的表达效率。 (3)pABTR中含有两个抗病毒病基因(rip和tcs)，其联合表达有望扩大植物的抗菌谱。 3.2草莓再生体系的建立 最佳生长培养基为：MS+1mgBA/L+0.2mgIAA/L，PH：5.8；最佳分化培养基为：MS+2mgBA/L+0.1mgIAA/L，PH：5.8最佳不定芽诱导培养基： “森嘎拉”为：MS+2mgTDZ/L+0.2mg2，4D/L，3％蔗糖，0.7％琼脂，PH：5.8；“戈雷拉”为：MS+2mgTDZ/L+0.1mgIBA/L+0.1mg2,4-D/L，3％蔗糖，0.7％琼脂，pH5.8最佳生根培养基为：MS+0.2mgIBA/L，PH：5.83.3农杆菌介导的遗传转化体系的建立 确立了“森嘎拉”在不定芽分化阶段的Km筛选压力为20mg/L，“戈雷拉”在不定芽分化阶段的Km筛选压力为25mg/L。 确定最佳除菌剂为阿莫西林：克拉维酸钾(2：1)，使用浓度为100mg/L。 获得了农杆菌介导法转化pABTR的“森嘎拉”抗性植株，抗性率为5.6％，获得了转化pABTR的“戈雷拉”抗性植株，抗性率为2.3％。 3.4转基因植株的分子生物学检测 (1)通过农杆菌介导法将pABTR分别转化“森嘎拉”、“戈雷拉”两个草莓品种，并获得了PCR阳性植株，其中： 森嘎拉转pABTR获得的抗性植株中，共检测了320株，其中tcs的PCR阳性植株数为43株，PCR阳性率为13.4％。含有tcs、rip两个基因的PCR阳性植株数为37株，阳性率为11.6％。 戈雷拉转pABTR获得的抗性植株中，共检测了217株，其中tcs的PCR阳性植株数为38株，阳性率为17.5％。含有tcs、rip两个基因的PCR阳性植株数为22株，PCR阳性率为10.1％。 不同基因型对转pABTR的转化效率不同，森嘎拉转pABTR的转化效率为0.65％，戈雷拉转pABTR的转化效率为0.23％。 (2)从PCR阳性植株中随机抽取森嘎拉5株，戈雷拉6株进行PCR-Southern检测，两个基因(tcs、rip)的阳性率均为100％。