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第一部分 APCmin/+-具核梭杆菌慢性感染-BMSC移植模型的建立与病理学特征研究目的:构建C57BL/6J-APCMin/+小鼠-具核梭杆菌慢性感染-BMSC移植模型,探讨BMSC对具核梭杆菌慢性感染致癌过程中的作用。方法:C57BL/6J-APCMin/+小鼠繁殖足够数量后按照造模干预因素随机分为4组:空白对照组(Control组)、单纯BMSC移植组(BMSC组)、具核梭杆菌慢性感染组((F.n组)、具核梭杆菌慢性感染+BMSC移植组(F.n+BMSC组)。经口接种APCMin/+小鼠F.n(ATCC25586)建立F.n慢性感染模型,分离并鉴定原代BMSC/GFP-BMSC,每周给予BMSC或PBS尾静脉注射,建立体内F.n慢性感染-BMSC移植模型,8周后处死造模小鼠,各存留数只观察每组APCMin/+小鼠生存期情况。HE染色评估小鼠结肠组织病理学特征,裸鼠成瘤实验检测F.n、BMSC在成瘤过程中的作用。结果:(1)从鉴定结果来看,繁殖APCMin/+小鼠后代APC突变率在12.5%-37.5%,平均突变率在20%左右;(2)F.n组小鼠可观察到体重减轻、少许血便、零星散在大肠肿瘤现象,BMSC移植8周后,F.n+BMSC组小鼠可观察到明显的体重减少、脱肛及便血情况,肿瘤数量及大小相较于F.n组具有统计学差异(P<0.05),且F.n+BMSC组小鼠较其它组生存期明显缩短(P<0.05),Control组及BMSC组无明显差异(P>0.05);(3)组织病理学结果提示:BMSC移植后,F.n+BMSC组小鼠高级别内瘤变及结肠癌发生率较其他组明显升高(P<0.05),移植BMSC促进结肠癌的发生;(4)激光共聚焦结果提示经F.n预刺激(Fn+BMSC+SW480组)的BMSC能够作为肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)进一步促进裸鼠皮下移植瘤的生长。结论:APCMin/+小鼠经口接种F.n(ATCC25586)可建立稳定的F.n慢性感染-结肠癌模型,BMSC明显促进具核梭杆菌慢性感染致结肠组织癌变的发展。第二部分 Wnt信号通路在BMSC参与具核梭杆菌相关性结直肠癌发生过程中的作用研究目的:探讨Wnt信号通路在BMSC参与具核梭杆菌相关性结直肠癌发病过程中的作用及意义。方法:体内构建C57BL/6J-APCMin/+小鼠-具核梭杆菌慢性感染-BMSC移植模型,收集结肠癌组织标本。应用Real-time PCR、Western blot、免疫共沉淀等方法分析结肠癌组织中胞质和胞核Wnt信号通路关键调控因子β-catenin、TCF4、Axinl、TGIF的表达情况。体外建立BMSC-F.n上清液-结肠癌细胞SW480及Transwell共培养体系,应用上述实验方法从体外进一步分析F.n感染对结肠癌Wnt信号通路活化及其关键因子表达水平的调控作用。结果:(1)体内Real-time PCR及Western blot结果显示F.n+BMSC组小鼠胞浆及胞核β-catenin、TCF4、TGIF表达水平较其他组均明显升高;(2)免疫共沉淀进一步分析显示Axinl与TGIF的结合从而抑制Axin-GSK3β-APC降解复合物形成,β-catenin蛋白表达量增加(P<0.05);(3)体外Real-time PCR及western blot结果显示SW480胞浆与胞核内β-catenin、TCF4表达水平较对照组均明显升高(P<0.05);(4)在F.n上清液的干预下,BMSC能够进一步增强结肠癌细胞的迁移及侵袭能力。结论:BMSC参与F.n慢性感染所致结肠组织癌变Wnt信号通路关键调控因子的异常表达,Wnt信号通路的异常活化可能是BMSC参与具核梭杆菌相关性结直肠癌的发病机制之一。第三部分Wnt3a在BMSC参与具核梭杆菌相关性结直肠癌Wnt信号通路激活过程中的作用目的:观察Wnt3a在BMSC参与具核梭杆菌相关性结直肠癌Wnt信号通路激活过程中的影响。方法:ELISA检测经F.n预刺激后BMSC上清液Wnt3a的含量,免疫组化、Western blot、免疫共沉淀等方法分析结肠癌组织内Wnt3a与TGIF的表达,体外构建Wnt3a-RNAi-BMSC慢病毒,应用上述实验方法从体内及体外干扰水平进一步分析F.n慢性感染对BMSC-Wnt信号通路活化及其关键调控因子表达的影响作用。结果:(1)Real-time PCR筛选发现经典Wnt信号通路配体中Wnt3a基因表达增加最为显著;(2)与其它对照细胞相比较,经F.n上清液干预的BMSC能够专一性高分泌Wnt3a蛋白;(3)Western blot结果分析显示Wnt3a与TGIF的蛋白表达量呈正相关;(4)移植Wnt3a-RNAi-BMSC后,Fn+BMSC组小鼠的便血及脱肛情况明显缓解,Westemblot结果显示组织内胞浆与胞核内β-catenin、TCF4表达水平较F.n组差异不明显(P>0.05);(5)干扰Wnt3a可以显著抑制BMSC对结肠癌细胞的迁移、侵袭及裸鼠成瘤作用。结论:BMSC参与F.n慢性感染所致结直肠癌组织中Wnt信号通路关键调控因子的异常表达,Wnt3a/β-catenin信号通路的异常活化是BMSC参与具核梭杆菌相关性结直肠癌的发病机制之一。