拥挤胁迫和亚硝酸盐胁迫对草鱼应激相关基因和泛素-蛋白酶体系统的影响

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鱼类是水生低等变温脊椎动物,对外界环境有较强的依赖性,其生存易受到外界环境因子的影响。不合理的养殖模式会引发水环境问题,对养殖鱼类产生刺激,从而导致鱼体生理机能的紊乱,耐药性降低,免疫力下降,水产品质量受影响,甚至引起鱼类的死亡。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)是调节蛋白质降解和功能的重要系统,它在细胞周期、凋亡、代谢调节、免疫应答、信号传递、转录控制、质量管理、应激应答、DNA修复等生物学过程发挥重要作用。在本研究中,探讨慢性拥挤胁迫和急性亚硝酸盐胁迫对草鱼幼鱼肌肉及肝脏组织中UPS活性、蛋白质代谢、应激反应、组织学等方面的影响,旨在为养殖环境控制提供基础科学依据。  慢性拥挤胁迫实验中,设2个试验组,一个是低养殖密度对照组(LSD),为5尾/缸(0.9kg/m2),另一个为高养殖密度胁迫组(HSD),为30尾/缸(5.9kg/m2),每个实验组设4个重复,实验进行70d。实验结束后,采集草鱼的血液与肌肉组织,进行相关基因相对表达量、泛素化蛋白含量、游离氨基酸浓度的检测。急性亚硝酸盐实验中,草鱼随机暴露于0mg/L、0.5mg/L、20mg/L的亚硝酸盐溶液中,在暴露后12h、24h、48h和96h时,采集血液、肝脏、鳃丝和肌肉样品,检测血液生化指标、组织nrf2、ksp70和UPS相关基因的表达、泛素化蛋白的含量以及组织学变化。  实验结果如下:  1.高密度养殖造成的拥挤胁迫对草鱼的生长产生了显著的抑制作用。在养殖结束后,草鱼背部白肌中,nrf2,keap1和hsp90的mRNA水平在两个密度组间没有显着差异。在UPS通路中,LSD组的ub,chip,psmc1的表达量显著高于HSD组。肌肉中泛素化蛋白表达水平和3-Methylhiistiden(3-MH)含量在LSD组表现出显著升高。LSD组中mafbx,murf1和s6k1的mRNA水平也显著高于HSD组。  2.亚硝酸盐胁迫实验中,血液中的皮质醇含量在亚硝酸盐胁迫12h时呈现显著的剂量依赖式升高,且在24h和48h显著高于对照组。谷丙转氨酶和谷草转氨酶的含量在96h显著性降低。在肝脏中,nrf2和hsp70的表达量在20mg/L亚硝酸盐胁迫12h后出现显著升高;20mg/L暴露组中chip的mRNA水平在12h、24h、48h显著升高,96h后与对照组相比无显著不同;Ub的表达量在亚硝酸盐胁迫不同时间点均存在剂量依赖式上升;20mg/L暴露组中psma2,psmc1的mRNA水平在24h显著升高,48h显著下降,96h基本恢复对照水平。在亚硝酸盐处理12h后,肝脏中泛素化蛋白含量出现显著提高,在96h时仍显著高于对照组。在高浓度亚硝酸盐胁迫96h后,肝细胞出现明显的空泡化。肌肉中,亚硝酸盐胁迫12h和24h显著降低了hsp70的表达量,且在48h显著提高其表达;Ub的表达水平在96h亚硝酸盐暴露组显著性高于对照组;Psma2,psmc1在亚硝酸盐胁迫下,在12h、24h和48h的表达量显著性下降,且与胁迫浓度呈现负相关;在0.5mg/L暴露组中murf1和mafbx的表达量在12h、24h和96h显著升高。背部肌肉泛素化蛋白的表达水平在胁迫24h显著升高,在48h及96h与对照组相比无显著差异。20mg/L亚硝酸盐胁迫96h后,肌肉组织没有显著性变化。鳃组织在20mg/L胁迫96h后出现明显毛细血管扩张、肿大,并形成动脉瘤。  综上所述,经过70d的养殖,草鱼幼鱼能够适应较为拥挤的养殖环境,低养殖密度中草鱼肌肉表现出更高的UPS活性,蛋白质合成及降解速度均较快。高浓度的亚硝酸盐胁迫导致草鱼产生了应激反应,显著提高了肝脏hsp70、nrf2的表达,造成肝细胞和鳃组织损伤,且激活了肝脏及肌肉中泛素-蛋白酶体系统清除损伤或错误蛋白以降低氧化损伤风险。
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