研究背景脊髓损伤(spain cord injury, SCI)是中枢神经系统的一类严重创伤,据统计数据显示：2006年全世界脊髓损伤的患病率为(233-755)／百万。而中国每年则约有八万左右的新患者,多由于车祸及坠落伤等原因造成的脊柱骨折、脱位所致,常遗留严重的伤残。脊髓损伤所造成的运动及感觉功能障碍,明显降低了患者的生存和生活质量。而传统的治疗方法仅限于脊柱骨折脱位的整复、固定、解除脊髓压迫及康复治疗等,但其治疗疗效欠佳。虽然在过去二十年里,世界各国研究者为此做出了巨大努力,却并没有获得显著的功能恢复。SCI的治疗仍然是一个世界性的医学难题。众所周知,脊髓损伤常常造成一系列病理改变,如机械力直接导致神经元细胞死亡；与高位中枢连续性中断；损伤节段以远突起遭受沃勒变性；脊髓断端新的神经胶质界膜形成并回缩以及二次损伤增加原发损伤面积等等。而在人类脊髓损伤病例中,损伤长度可能达到1cm,甚至更广泛。然而伤后神经再生过程相当复杂,尽管会出现内生性重建：如轴突出芽生长、炎症细胞、内皮细胞以及雪旺细胞侵入损伤区域等。但是仅仅依靠这些内在的修复进行重建所取得的功能提高非常有限。过去多年的研究表明造成轴突再生受限的原因至少包含以下几点：1,缺乏支持轴突延长通过损伤区域的基质；2,缺乏必要的神经营养支持；3,损伤区域的髓鞘及细胞抑制因子的存在；4,成熟神经元再生能力有限；5,炎性反应造成的更严重的二次损伤；而慢性损伤存在更多的障碍,如损伤区域周围胶质疤痕的形成；遭受慢性损伤的神经元对再生相关基因的敏感程度下降,甚至萎缩等。近20年广大研究者针对影响神经损伤再生的各种因素,做了许多尝试,如提高损伤后神经元的存活、抑制损伤后胶质疤痕生长、种子细胞或支架移植以及促再生因子的应用等等,都取得了一定的修复效果。随后,越来越多的研究表明联合治疗策略较单一治疗策略应用于脊髓损伤修复更有效。如分解硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)分子糖链的软骨素酶ABC (ChABC)与承载有雪旺细胞的支架的应用能促进轴突再生通过移植物-宿主界面；浸有神经营养因子的雪旺细胞支架提高再生轴突进入支架内部；神经营养因子3与环磷酸腺苷的联合应用促轴突再生通过损伤区；神经干细胞与过表达神经营养因子的雪旺细胞联合移植促进损伤后脊髓功能及结构改善等。神经营养因子由于其对神经元存活及神经突外生起重要作用而备受关注。其家族成员包括神经生长因子(Nerve growth factor, NGF)、脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、神经营养因子-3(Neurotrophin-3, NT-3)、神经营养因子-4/5(Neurotrophin-4/5, NT-4/5)、神经营养因子-6(Neurotrophin-6, NT-6)等。它们为不同亚型的神经元生长、分化和维系所需要。由于NT3-mRNA在中枢神经系统中广泛表达,且NT3能通过结合Trk酪氨酸激酶受体C(TrkC)激活下游Rho GTPases家族,作用于细胞中微管及肌动蛋白丝推动突起生长延伸；同时NT3也是调节髓鞘形成的重要介质,可以促进重要的运动通路如皮质脊髓束(corticospinal tracts, CST)的生长等,使其在脊髓损伤修复研究中显得尤其重要。但是由于神经营养因子价格高昂使其广泛应用受到限制。已有尝试各种方式将外源性神经营养因子应用于脊髓损伤的研究以期克服外源性给药方式的缺陷,包括：损伤处直接注射、移植微量渗透泵、移植浸润NT3的胶原基质、病毒载体转运NT3等等。然而经这样单一的外源性给药方式,虽然有一定的促受损神经突起再生的作用,但是再生的突起常常是无序随机生长的,无法达到接近原来脊髓传导回路,功能提高作用有限。目前,得益于组织工程学的快速发展,各种来源的材料如：高分子材料聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)、胶原等被制作成有利于脊髓损伤修复的支架用于研究,以及将制成的支架联合多种策略共同应用取得了一定的疗效。而胶原材料由于其容易获取、可塑性强以及良好的生物相容性等优点被广泛应用于修复研究中。本课题组通过前期对神经营养因子3(NT3)进行改造,构建具有胶原结合区的NT3 (collagen-binding domain neurotrophin-3, CBD-NT3),使其能与胶原特异结合,并已取得较肯定的效果。本课题通过对有序胶原支架联合胶原靶向神经营养因子-3引导细胞突起迁移生长及其生物相容性的研究,证明了这种联合策略用于脊髓损伤修复的可行性。第一部分有序胶原支架联合胶原靶向NT3引导细胞突起定向生长目的：研究天然有序胶原材料联合有胶原靶向结合域的NT3对细胞突起延伸的影响,探讨这种联合策略对脊髓损伤修复的意义,为进一步联合细胞移植治疗脊髓损伤奠定基础。方法：从SD大鼠尾抽取足够量肌腱制备胶原支架,尽可能去除黏附组织,并修剪至合适大小的样本,进一步行去细胞及灭菌处理。利用HE染色评价支架的去细胞处理效果；经灭菌后的去细胞支架浸泡负载CBD-NT3后,将其与新生24h的SD大鼠背根节细胞(Dorsal root ganglion cells,DRGs)体外共培养,同时设NT3、PBS组作为对照。分别在第1、3、5d对支架上细胞行FDA(Fluorescein diacetate)荧光染色,并测量分析各组细胞突起的延伸长度及角度；在共培养第3d后,利用扫描电镜观察共培养后支架和背根节细胞的超微结构,分析支架地貌对细胞形态及突起延伸的影响。结果：HE染色显示经处理后支架内细胞成分基本去除,而未经处理过的胶原支架内部可见较多核染色,同时可见经处理后的胶原支架同未经处理的胶原材料形态基本保持一致；共培养第1d三组支架上细胞突起延伸长度无显著差异(P>0.05),但之后支架上细胞开始贴壁生长延伸,至第3d后CBD-NT3组细胞突起延伸长度最长,其次为NT3组,PBS组最小,CBD-NT3组的细胞突起迁移长度与其他两组间差异具有统计学意义(P<0.05),但在共培养第5d后CBD-NT3组与NT3组细胞突起延伸长度差异无统计学意义(P>0.05),却仍然较PBS组长(P<0.05)。同时在支架上生长延伸的细胞突起呈现沿支架长轴定向生长的趋势,而支架以外的细胞突起则呈无序随机的生长方式；细胞突起延伸角度进一步表明：细胞突起总体延伸方向与胶原支架纤维长轴基本保持平行,夹角<30。。而且突起延伸方向在随着延伸距离增加时,非但没有偏离支架纤维长轴,反而有倾向平行的趋势；扫描电镜显示细胞是依靠支架表面地貌锚定和生长的。结论：鼠尾肌腱经这种去细胞处理方式能达到较好的去细胞效果,而且方便易行,同时仍能保持肌腱原有的纵型胶原纤维结构；具有胶原靶向结合的NT3联合有序胶原支架能发挥定向引导及更好地促细胞突起延伸的双重功效,能为脊髓损伤修复研究提供一种有效的治疗途径。第二部分胶原支架的细胞相容性及其联合胶原靶向NT3体内移植的组织相容性目的：研究经处理后的胶原支架对细胞增殖的影响以及其联合胶原靶向NT3体内移植的组织学反应,评价这种联合策略在体内应用的可行性。方法：将经去细胞处理支架与骨髓基质细胞体外共培养,以单独的骨髓基质细胞作为对照组,分别在第1、2、3d,利用CCK-8测量各组细胞增殖情况；将未处理支架、经去细胞处理支架以及负载有CBD-NT3、NT3的经处理胶原支架分别行Wistar大鼠背部皮下埋植,每只大鼠背部一侧依次按照未处理支架、经去细胞处理支架、负载有CBD-NT3的经处理胶原支架以及负载有NT3的经处理胶原支架的顺序进行埋植,两侧共埋植8处,共6只大鼠,分别在1周和4周后取材,并用HE染色评价大鼠皮下埋植物的组织学反应。结果：经去细胞处理后的支架与骨髓基质细胞共培养后CCK-8检测发现,经共培养的细胞与单独细胞培养两组在第1d、2d、3d的0D值均无显著差异(分别为1d:P=0.520；2d:P=0.601；3d:P=0.810)；皮下埋植的组织学结果显示：在第1周和第4周处理支架组支架外周反应细胞密度较未处理组少,差异具有统计学意义(1周：P=0.000；4周：P=0.024),而在第1周,两组间侵入支架内部的细胞密度无显著差异(P=0.067),至第4周时,未处理支架组侵入支架内部细胞密度较处理组多,差异具有统计学意义(P=0.000)。对比经处理胶原支架联合NT3与经处理胶原支架联合CBD-NT3的组织学反应显示：在第1周及第4周时,无论支架外周反应细胞密度或侵入支架内部的细胞密度均无统计学差异(P>0.05)。结论：经去细胞处理后的胶原支架不影响骨髓基质细胞增殖,且体内炎症反应较未处理胶原支架轻微；其与CBD-NT3联合体内埋植实验证明在第1周及1月后并未出现引起组织炎症反应加剧的情况,这种经处理后的支架联合构建的具有胶原靶向结合区的NT3可以用于脊髓损伤修复以及以后联合种子细胞移植多策略协同治疗脊髓损伤的研究中。