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目的 观测来源于小鼠的骨髓间充质干细胞(BM-mMSCs)经诱导分化为胰岛素分泌细胞及其种植于大鼠胰腺脱细胞支架中的定植、生长和功能发挥状态,为体外再造类胰岛器官提供理论与实验基础。方法1.将含小鼠胰岛发育的重要转录因子PDX-1,MafA和NeuroD1的腺病毒联合导入BM-mMSCs中,诱导其分化为胰岛素分泌细胞,qRT-PCR和免疫荧光检测胰岛相关标志物基因和胰腺β细胞特异性基因的表达;再通过酶联免疫吸附测定(ELISA)不同浓度葡萄糖刺激后分化细胞的胰岛素分泌情况。2.经脾动脉持续灌注洗脱剂1%TritonX-100/0.1%氨水制备大鼠胰腺脱细胞支架,进行HE染色、Masson染色、扫描电镜观察、GAG含量检测,免疫组化检测细胞外基质成分Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白,DNA含量检测细胞残留、体外动物实验进行脱细胞支架生物相容性检测。3.将诱导获得的胰岛素分泌细胞再种植于大鼠胰腺脱细胞支架内,继续三维循环灌注培养,再行组织学检测并以免疫荧光、qRT-PCR检测分化细胞胰岛素蛋白及基因水平表达,评估其生长及功能发挥的情况。结果1.PDX-1,MafA和NeuroD1协同作用促进BM-mMSCs分化为胰岛素分泌细胞。qRT-PCR和细胞免疫荧光显示胰岛素基因和蛋白表达阳性,PDX-1、NeuroD1、MafA、Glut 2、Nkx6.1、islet-1胰腺标志物基因表达阳性,葡萄糖刺激试验结果显示诱导获得的细胞对不同浓度的葡萄糖溶液刺激有反应。2.经1%TritonX-100/0.1%氨水灌注后,大鼠胰腺呈透明状,台盼蓝染色显示胰腺组织内血管结构保存完好。HE染色结果显示未见细胞残留,Masson三色染结果显示胰腺支架内细胞外基质成分得以保留,免疫组织化学结果显示Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白基本保留,扫描电镜显示胰腺脱细胞支架的超微结构,GAG含量结果显示有所减少,DNA含量结果显示胰腺细胞基本去除,生物相容性检测提示胰腺脱细胞支架良好的生物相容性。3.获得的有胰岛素分泌功能的分化细胞种植于大鼠胰腺脱细胞支架中,继续循环灌注培养,通过组织性检测证实分化细胞在支架间质和脉管中定植并生长,免疫荧光示胰岛素表达阳性,qRT-PCR显示胰岛素基因与传统二维培养相比,基因表达水平明显提高。结论1.胰腺转录因子PDX-1,MafA和NeuroD1三者能协同作用,促进BM-mMSCs分化并获得显著的胰岛素合成和分泌能力。2.经1%TritonX-100/0.1%氨水灌注得到的大鼠胰腺脱细胞支架不仅保存了基本的脉管结构,且具有良好的理化性质和生物相容性。3.经三维循环灌注培养,胰腺脱细胞支架能为胰岛素分泌细胞提供良好的生长及功能发挥环境。