拟南芥nudt6-2nudt7-1双突变体的自身免疫反应植物的先天免疫系统由两部分组成。一条通路依赖于植物中pattern recognition receptors (PRRs)对pathogen associated molecular patterns (PAMPs)的识别。两个得到广泛研究的例子是植物通过受体激酶FLS2识别细菌的鞭毛蛋白和通过EF-Tu receptor (EFR)识别细菌的延伸因子Tu (EF-Tu)。对PAMPs的识别启动了下游的免疫反应,称为PAMP-triggered immunity (PTI)。病原菌为了抑制宿主的PTI,通过type III secretion system向宿主细胞内输送效应分子(effector),负调控宿主的抗病反应。为了应对这些效应分子,植物进化出另一种监视系统,通过resistance (R)基因的产物特异性地识别病原菌的效应分子。R蛋白对效应分子的识别可以是直接的,也可以是间接的。这种识别启动了强烈的抗病反应,称为effector-triggered immunity (ETI)。 ETI往往伴随着病原菌侵染部位的超敏反应。植物抗病反应的发生和强度需要受到严格的调控,从而确保正常的生长发育。这一点对于ETI尤其重要。ETI的反应往往十分强烈,如果不受控制,会造成组成型的抗病反应。R基因决定着ETI途径的信号输入。近年来发现,很多突变体的组成型抗病反应往往是R基因的活性不受控制造成的。R基因的转录需要受到严格的调控。SNC1和RPS4是两个TIR-NB-LRR型R基因,它们的过表达会造成自身免疫反应。如果抗病途径的负调控因子突变,同样会造成自身免疫反应。一个这样的例子是cprl基因。CPR1是一个含有F-box的蛋白,它的作用是抑制R蛋白SNC1和RPS2的积累。抗病反应的另一个负调控因子是AtNUDT7o AtNUDT7被敲除的植物表现出组成型PR基因过表达、SA大量积累和细胞自发死亡,同时对于一些有毒菌株和无毒菌株表现出更强的抗性。以前的研究表明,AtNUDT7负调控EDS1途径。EDS1对于基础抗病反应(包括抵御一些毒性的生体营养性病原菌和半生体营养性病原菌)以及由TIR-NB-LRR型R基因介导的ETI是必需的。研究表明EDS1蛋白在被激活的TIR-NB-LRR的下游起着传递信号的作用。在拟南芥的基因组中,和AtNUDT7同源性最高的蛋白质是AtNUDT6。我们发现nudt6-2nudt7-1双突变体表现出典型的自身免疫反应,包括植株极其矮小,抗病相关基因组成型过表达,和严重的自发细胞死亡。通过对nudt6-2nudt7-1双突变体的研究,我们确定AtNUDT6和AtNUDT7都是EDSl途径的负调控因子。它们抑制了SNC1和其他R基因的活性。我们还发现nudt6-2nudt7-1双突变体的表型在28℃受到抑制,这可能是由于28℃抑制了R基因的活性。另外,如果培养基中硝酸／氨的比例较低,nudt6-2nudt7-1双突变体的表型也会受到抑制。这种抑制可能是由植物体内较低的一氧化氮(NO)水平造成的。我们的发现将有助于深入理解植物负调控抗病反应的机理以及EDS1涂释和NO涂释的相百作用。用蛋白质组学技术发掘对氧化还原敏感的蛋白质植物在受到一些非生物胁迫或生物胁迫时,一个重要的反应是产生活性氧分子(ROS)。越来越多的研究表明,ROS并不仅仅是具有细胞毒性的代谢副产物,而且在调节植物对环境的应答中起着信号分子的作用。ROS对信号的传递主要是通过氧化它们在细胞中的底物(如氧化还原敏感的蛋白质)实现的。通过氧化修饰调控蛋白质的功能是调节各种生理过程的一个重要分子机制。在本项研究中,我们利用蛋白质组学技术分析了在受到过氧化氢处理的拟南芥悬浮细胞中的氧化还原敏感蛋白。我们使用了四种基于双向电泳的方法发掘在过氧化氢处理下巯基受到氧化修饰的蛋白质。通过每一种方法都鉴定得到一个蛋白质集合。这四个集合之间只有少量的重复。对于鉴定得到的一些氧化还原敏感蛋白质,我们进一步验证了它们在受到氧化胁迫的拟南芥叶片中受到了氧化修饰。验证的方法是基于巯基的差异标记以及后续的免疫共沉淀和Western印记技术。我们还完善了另一种验证方法。这种方法基于巯基的差异标记和对于蛋白质泳动率迁移的检测。使用这种方法,我们证明了拟南芥的AtCIAPIN1蛋白(和人cytokine-induced apoptosis inhibitor 1蛋白同源)在拟南芥的叶片受到水杨酸和多肽flg22(诱导抗病反应的信号分子)处理的情况下也能够被氧化。本项蛋白质组学研究鉴定的氧化还原敏感蛋白质参与了各种不同的生物学过程,包括代谢、抗氧化胁迫、蛋白质合成及修饰、细胞骨架的构建等。发现新的氧化还原敏感蛋白将会有助于更好地理解细胞内未知的、受氧化还原调控的成分或通路。拟南芥中内源mART活性催化蛋白质单二磷酸腺苷核糖化修饰蛋白质的单二磷酸腺苷核糖化(mono-ADP-ribosylation)是一种重要的翻译后修饰方式。在这一反应中,来自于β-NAD+的ADP-ribose基团在单二磷酸腺苷核糖转移酶(mono-ADP-ribosyltransferase, mART)的催化下被共价连接到各种蛋白质底物上。这种类型的修饰可以调节底物蛋白的活性和功能,在动物、酵母和原核生物中已经得到广泛研究,但是在植物中还没有报道过。在本项研究中,通过[32P]NAD+对蛋白质的标记,我们发现并研究了拟南芥中受到二磷酸腺苷核糖化修饰的蛋白质,这一反应是由一个内源的酶催化的。在拟南芥的叶片蛋白抽提物中我们发现一个分子量为32 kDa的底物蛋白可以被同位素标记。通过热处理、蛋白酶处理以及核苷酸衍生物竞争实验证明,[32P]NAD+共价修饰了这个32 kDa蛋白质。[carbonyl-14C]NAD+不能标记这个32 kDa蛋白质,说明这一修饰是二磷酸腺苷核糖化修饰。一些化合物可以裂解特定氨基酸残基的单二磷酸腺苷核糖化修饰基团,这些化合物可以破坏NAD+和这个32 kDa蛋白质的共价连接,而Poly (ADP-ribose) polymerase抑制剂不能抑制这种共价连接。这些结果说明这种反应并不是多聚二磷酸腺苷核糖化(poly-ADP-ribosylation),而是单二磷酸腺苷核糖化。这种修饰主要存在于叶片中,而且会在氧化胁迫的条件下增强。在幼苗中,我们还发现了另外的两个底物蛋白质。一个蛋白质的分子量为45 kDa,另一个超过130 kDa。这说明在不同的发育阶段存在不同的底物蛋白。尽管底物蛋白的身份现在还不清楚,这是第一次在植物中发现由植物内源的酶所催化的单二磷酸腺苷核糖化反应。