狂犬病是全球流行、危害严重的人兽共患病,由嗜神经性的狂犬病病毒(rabies virus,RABV)感染所引起。自2007年以来,我国人狂犬病疫情持续下降,但每年仍有1000例左右,且流行区域有不断扩大的趋势,这对于动物免疫覆盖率不高的我国大部分地区而言,形势仍然相当严峻。人在狂犬病的传播中居于最后一个环节,几乎所有人的狂犬病都是从动物传播而来。因此,人狂犬病的根本控制需要从源头入手,即控制流浪犬和野生动物狂犬病的传播。流浪动物和野生动物狂犬病唯一可行的控制方式是口服免疫。口服疫苗有两类,分别为减毒活疫苗和重组活载体疫苗,其中减毒活疫苗主要在欧洲使用,因存在一定的残存毒力,不适用于流浪犬或与人群接触较多的野生动物。目前,美国、加拿大和欧洲分别批准了以痘苗病毒和人5型腺病毒为载体表达狂犬病病毒糖蛋白的重组疫苗在不同野生动物种群中的应用或试验研究,有效降低了动物狂犬病的发病率,取得了良好的免疫效果。但我国尚无类似疫苗上市,而从长远发展来看,口服疫苗的研制和应用才是我国流浪犬和野生动物狂犬病控制的必经之路。副流感病毒5型(Parainfluenza virus 5,PIV5)系副黏病毒科(Paramyxov iridae),腮腺炎病毒属(Rubulavirus),其基因组为单股负链RNA,该病毒于1956年自猴体内首次分离,故以往称之为猴病毒5型(Simian virus 5,SV5)。临床上,该病毒可引起犬病发“犬窝咳”,除此之外,本实验室于2013年在长春白城地区肉牛养殖场发现该地区犊牛亦可感染该病毒(分离毒株为PV5-BC14株)而暴发呼吸道疾病。随着负链RNA病毒的反向遗传学技术的发展,PIV5因其感染方式直接、宿主范围广泛、基因组相对稳定、在大多数细胞中可获得高滴度的病毒等诸多优点而备受关注,先后成为流感病毒、RABV等重要病原的重组疫苗载体,具有广阔的应用空间和巨大的经济价值。本研究尝试以PIV5犬源疫苗株(CC-14株)为载体,建立其反向遗传学操作系统,使之表达具有良好免疫原性的RABV BD06株糖蛋白,旨在研制一种免疫效果较好的新型狂犬病重组口服疫苗。此外,本研究发现,PIV5牛源PV5-BC14株与犬源CC-14株同源性最高(基于NP基因编码区序列)。而且近年来,牛感染狂犬病的情况在新疆、内蒙古、黑龙江等地常有发生,且多由狐狸、流浪犬咬伤引起。因此,以piv5犬源疫苗株cc-14株作为载体的狂犬病重组疫苗的研究对于犬和牛狂犬病的预防都有实际意义。本研究的试验过程及相应结果概述如下:1.piv5cc-14株全基因组测序及分析:根据genbank中报道的sv5株全基因组序列设计14对引物,通过rt-pcr方法获得了覆盖全长的14个基因片段,并将这些片段分别克隆进pmd18-t载体中,以通用引物进行序列测定、拼接并分析。结果显示,piv5cc-14株的全基因组大小为15246nt(基因库登录号为kp893891),其与大多数piv5毒株基因组结构的不同之处在于cc-14株没有sh基因。以高度保守的1530bpnp基因序列对现有piv5毒株进行同源比对和系统发生分析,同源比对结果表明,piv5cc-14株与其他17株参考序列的核苷酸同源性为97.25%~99.80%,推导氨基酸同源性为98.62%~99.80%;系统发生分析表明,cc-14株和牛源pv5-bc14株同属一个分支。2.piv5cc-14株感染性克隆的构建:对piv5cc-14基因组全长进行酶切图谱分析,根据酶切位点的分布,设计7对引物,分段进行rt-pcr扩增得到目的基因片段,经过一系列酶切、连接、亚克隆、克隆等过程,构建出基因组全长cdna:ppiv5,该质粒中预设了外源基因的插入位点notⅠ。为验证该反向遗传系统的完善性,将两端含有piv5转录复制元件的egfp编码区基因按照上述常规实验方法插入ppiv5的notⅠ位点,从而构建出ppiv5-egfp;基于rabv强度株bd06的糖蛋白具有较好的免疫原性,将两端含有piv5转录复制元件的bd06糖蛋白(glycoprotein,g)编码区基因插入ppiv5的notⅠ位点,从而构建出ppiv5-bd06-g。为提高病毒的拯救效率,在构建基因组全长cdna时,在基因组cdna上游引入t7启动子,使基因组全长cdna置于t7启动子下游,另外,在基因组cdna下游引入丁肝病毒核酶结构(hdvrz)。此外,按照上述常规试验方法分别构建三个辅助质粒pcdna3.1-np、pcdna3.1-p和pcdna3.1-l。上述试验所得质粒分别经酶切鉴定、序列测定、拼接和分析,最终确定所有质粒序列准确无误。3.piv5cc-14株重组病毒的拯救:将验证质粒ppiv5-egfp,辅助质粒pcdna3.1-np、pcdna3.1-p和pcdna3.1-l共转染培养于6孔板中的bhk-t7细胞,待转染48h后,将细胞转移至细胞瓶中培养3-4天,观察是否有荧光,目前本实验仍在进行中。4.重组病毒拯救辅助细胞系的构建(稳定表达t7rna聚合酶的mdck细胞系的构建):鉴于piv5cc-14株在mdck细胞生长良好,因此我们尝试采用mdck细胞来构建一个稳定表达t7rna聚合酶的mdck细胞系,用于将感染性克隆包装成病毒。首先,通过G418筛选确定MDCK细胞的G418最低致死浓度为1300μg/ml;其次,将表达T7 RNA聚合酶的质粒pcDNA3.1-T7质粒转染正常MDCK细胞,次日施加1300μg/ml的G418压力,此后,每隔两天更换一次1300μg/ml的G418培养基,两周后将生长出来的细胞采用有限稀释挑取单克隆;最后,将挑取的单克隆细胞转染验证质粒pUC57-IRES-T7-EGFP以及其他方法验证是否获得该细胞系,此实验仍在进行中。5.PIV5 CC-14株检测方法的建立:由于该病毒没有细胞病变(CPE),我们分别用RT-PCR、间接免疫荧光试验、血细胞吸附、血凝试验这四种方法来检测该病毒,研究表明,这些方法中血细胞吸附是一种非常便捷的方法。总结:1.本研究完成了PIV5 CC-14株全基因组测序(登录号:KP893891)及分析。2.构建了pcDNA3.1-NP,P,L三个辅助质粒以及pPIV5,pPIV5-EGFP,pPIV5-BD06-G三个全长质粒。3.建立了便捷的血细胞吸附的方法检测PIV5 CC-14株。4.稳定表达T7 RNA聚合酶的MDCK细胞系的构建以及重组病毒的拯救实验仍在进行中。论文的创新点:1.本课题是国内首次尝试将PIV5病毒载体用于狂犬病重组疫苗研究,旨在进行狂犬病的口服免疫研究,本项研究对于犬和牛狂犬病的预防都有实际意义;2.RABV BD06株由本实验室分离,其为能够代表我国狂犬病流行毒株特点的经典毒株,且本实验室前期工作已证明该毒株糖蛋白(G)具有良好的免疫原性,故本实验尝试将BD06-G作为外源基因插入pPIV5中,以期获得免疫效果更好的新型狂犬病口服疫苗。