本研究的主要目的是以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,研究赖氨酸、蛋氨酸及赖氨酸蛋氨酸配比模式对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白合成的影响,旨在探讨体外培养条件下乳蛋白合成的最佳赖氨酸蛋氨酸配比模式,揭示在最佳配比模式下转录和翻译水平上影响乳蛋白合成的分子机制,以提高乳中乳蛋白的含量,从而为改善牛奶质量提供理论依据。研究包括三部分:1.以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,利用噻唑蓝（MTT）法来探讨不同浓度梯度的赖氨酸、蛋氨酸添加水平及培养时间对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响,得出赖氨酸、蛋氨酸作用的最佳浓度范围和最优的培养时间为后续实验做参考,同时也为阐明二者提高奶牛乳腺上皮细胞增殖的机制提供数据参考和理论依据。试验采用完全随机设计,赖氨酸在培养基中的添加浓度分别为0、0.05、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6 mmol/L,蛋氨酸在培养基中的添加浓度分别为0、0.025、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mmol/L;培养期为24、48和72 h。试验重复3次。结果表明:赖氨酸在0.8～1.6 mmol/L、蛋氨酸在0.4～0.8 mmol/L浓度范围内对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞增殖的促进作用最明显且在48 h时增殖作用最强（P<0. 01）。2.以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,研究添加赖氨酸、蛋氨酸对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成的影响。试验选择七种水平的赖氨酸（0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mmol/L）和六种水平的蛋氨酸（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）为处理组。试验期为48 h,每个处理3个重复,试验重复3次。采用ELISA方法检测试验组乳腺上皮细胞中总酪蛋白的含量。通过拟合曲线得出最佳的赖氨酸、蛋氨酸添加水平,同时采用荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）染色法检测赖氨酸、蛋氨酸在最佳添加水平时对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响;并采用Real-Time PCR技术检测此水平下编码乳蛋白基因、与乳蛋白合成转录和翻译相关的基因以及赖氨酸、蛋氨酸相关的转运载体CAT-1和ASCT-2的表达。结果表明:1)以酪蛋白的合成量（y）为纵坐标,赖氨酸的浓度（x）为横坐标,拟合曲线y= -0.336X²+0.792X+1.983 （R²=0.965）,得出赖氨酸的最佳添加浓度为1.2 mmol/L。此水平下,与对照组相比促进了奶牛乳腺上皮细胞的增殖。α_s1-酪蛋白(α_s1-casein, CSN1S1)、α_s2-酪蛋白(α_s2-casein, CSN1S2)、β-酪蛋白（β-casein, CSN2）、κ-酪蛋白（κ-casein, CSN3）和α-乳白蛋白（α-lactalbumin,LALBA）基因表达均上调,且与未添加赖氨酸的对照组相比差异极显著（P<0.01）。赖氨酸转运载体CAT-1基因的表达上调且差异极显著（P<0.01）。与乳蛋白合成转录相关的STAT5-JAK2信号通路的基因,信号转换和转录激活因子5（signal transducers and activators of transcription 5,STAT5）、蛋白质酪氨酸激酶2（Janus Kinases 2,JAK2）、ets结构域转录因子5（ets domain transcription factor,ELF5）表达均显著上调,且STAT5和JAK2差异极显著（P<0.01）。与乳蛋白翻译相关的哺乳动物雷帕霉素标靶（mammalian target of rapamycin,mTOR）信号通路的基因mTOR和p70核糖体蛋白S6激酶（ribosomal protein S6 kinase-1,S6K）基因的表达均上调且mTOR差异极显著（P<0.01）,但真核翻译起始因子4E结合蛋白1（Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1, EIF4E-BP1）表达下调。2)以酪蛋白的合成量（y）为纵坐标,蛋氨酸的浓度（x）为横坐标,拟合曲线y= -2.736X²+2.851X+1.984 （R²=0.95）,得出蛋氨酸的最佳添加浓度为0.5 mmol/L。此水平下,与对照组相比促进了奶牛乳腺上皮细胞的增殖。CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3和LALBA基因表达均上调;除CSN2外,其他基因与未添加蛋氨酸的对照组相比差异极显著（P<0.01）。蛋氨酸转运载体ASCT-2基因的表达上调且差异极显著（P<0.01）。与乳蛋白转录相关的STAT5-JAK2信号通路的基因STAT5、JAK2、ELF5表达均显著上调,且STAT5和JAK2差异极显著（P<0.01）。与乳蛋白翻译相关的mTOR信号通路的基因mTOR和S6K基因的表达均上调但差异不显著,但EIF4E-BP1表达下调且差异极显著（P<0.01）。3.以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,研究赖氨酸蛋氨酸配比模式对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成的影响。试验采用3×5复因子试验设计,以蛋氨酸（0.4、0.5、0.6 mmol/L）和赖氨酸（1.0、1.2、1.4、1.5、1.6 mmol/L）的混合物作为试验处理。试验期为48 h,每个处理3个重复,试验重复3次。通过ELISA方法检测添加蛋氨酸和赖氨酸混合物后细胞中酪蛋白的合成量。得出最佳的赖氨酸蛋氨酸配比模式,并采用Real-Time PCR技术检测此水平下乳蛋白基因、与乳蛋白合成转录和翻译相关的基因以及与赖氨酸、蛋氨酸相关的转运载体CAT-1和ASCT-2的表达。结果表明:蛋氨酸（0.4 mmol/L）和赖氨酸（1.2 mmol/L）混合添加时奶牛乳腺上皮细胞总酪蛋白合成量最高为2.95ppm,并差异极显著（P<0.01）。当赖氨酸和蛋氨酸以1.2 mmol/L和0.4 mmol/L即3:1混合添加时在不影响赖氨酸、蛋氨酸相关的转运载体CAT-1和ASCT-2基因表达的条件下（P>0.05）均能极显著地促进乳蛋白基因的表达如:CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3和LALBA基因表达均上调（P<0.01）,且CSN1S1和LABA表达量最高。与乳蛋白转录相关的STAT5-JAK2信号通路基因的表达均显著上调（P<0.01）;与乳蛋白翻译相关的mTOR信号通路的相关基因除EIF4E-BP1显著下调（P<0.01）,mTOR和S6K基因的表达均上调且mTOR差异极显著（P<0.01）。综合本研究结果,当赖氨酸和蛋氨酸以1.2 mmol/L和0.4 mmol/L浓度即3:1比列添加时细胞中总酪蛋白的合成量最大,并显著地促进了乳蛋白基因的表达以及与乳蛋白合成相关路径的基因的表达。