出血性中风多发生在中、老年高血压病人,是一种常见、多发病,由于其高病死率、高致残率,严重危害人类健康。近年来,大量文献显示,人们对缺血再灌注损伤所致的缺血性中风研究较多,而对出血性中风研究相对较少。本研究是在我们已往多年的工作基础上,以活血化瘀、清热解毒、化痰开窍法方药—救脑宁注射液为基础,以脑血肿周围损伤组织的神经细胞凋亡变化为切入点,从整体、细胞、分子、基因水平深入探讨中医药对实验性脑血肿以及原代神经细胞拟缺血再灌注损伤的保护作用,这将对指导中医临床及深入研究中医药有效方剂的作用机制提供实验依据。 本论文包括三部分:(1)救脑宁注射液对实验性脑血肿家兔治疗作用的研究:复制家兔实验性脑血肿模型,观察脑组织病理学变化的演变规律,以及救脑宁注射液的治疗效应;(2)救脑宁注射液对缺血再灌注诱导原代神经细胞损伤的影响:在体外培养神经细胞拟缺血再灌注损伤模型上,观察救脑宁注射液抗损伤作用的细胞代谢、形态学与凋亡变化;(3)救脑宁注射液改善缺血再灌注所致原代神经细胞凋亡及其调控机制的研究:从细胞、分子、基因水平,在原代神经细胞拟缺血再灌注损伤模型基础上,试图从凋亡发生的两条主要途径:线粒体途径和死亡受体途径、Caspase-3 蛋白酶级联反应以及相关的上游调控基因等方面阐明救脑宁注射液抗神经细胞凋亡的作用环节与机制。 家兔脑血肿整体动物实验分为六组:正常对照组(Control),模型组(Model),救脑宁高剂量组(JNN-H),中剂量组(JNN-M),低剂量组(JNN-L)和清开灵注射液组(QKL)。实验各组分别在造模后 3、7、15 天(d)取材,观察动物一般情况、脑系数、脑组织含水量、脑组织 HE、Nissl’s、Mallory 染色、投射电镜形态学变化以及 TUNEL 染色显示凋亡细胞等指标变化,并采用计算机图像分析系统对相关形态学指标进行定量分析。 体外培养神经细胞拟缺血再灌注损伤实验也同样分为上述六组即:Control,Model,JNN-H,JNN-M,JNN-L,QKL。实验各组分别于单纯缺血 2 小时(h)及缺血 2h+再灌注 4h取材,检测细胞代谢率(MTT)、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、细胞凋亡率(流式细胞技术)、形态学、细胞 DNA 和 RNA 变化(AO 染色)、线粒体膜电位(流式细胞技术)、细胞内 pH 值(流式细胞技术)、细胞内 bcl-2/bax、Fas/FasL、Caspase-3 蛋白的表达以及RT-PCR 检测 bcl-2/bax mRNA 表达等指标变化,用计算机图像分析系统对相关指标进行定量分析。 主要实验结果如下: 1. 救脑宁注射液可改善实验性脑血肿家兔一般状态,减轻脑水肿及病理组织学变化,抑制凋亡发生 实验动物造模后,健侧(左侧)肌力下降,尤以前肢为重,行走病侧(右侧)偏转步态,以术后 7-9 天内明显;造模后 3、7、15 天,分别出现不同程度的脑水肿、脑组织含水量增加,以 3、7 天为重;脑组织病理形态学观察可见:(1)造模 3 天时,脑组织以广泛的细胞与间质水肿和出血为重,神经细胞不同程度的变性、坏死;(2)造模 7 天时,脑组织水肿仍较明显,出血现象有不同程度的改善,血肿周围脑组织出现明显的炎细胞反应与胶质增生现象,可见少量格子细胞;(3)造模 15 天时,从脑组织形态学变化上看,<WP=4>-2- 救脑宁注射液治疗实验性脑血肿家兔的作用及其机制研究脑组织水肿已不十分明显,出血现象也有减轻,血肿周围脑组织的胶质反应性增生及炎细胞浸润现象更加明显,并可见较多的格子细胞,血肿有明显的吸收表现。脑组织 TUNEL 染色,造模后皆有明显的阳性深染细胞出现,但以 7 天时凋亡表现最重。 救脑宁注射液高、中、低剂量组,在各取材时间点表现出不同程度地减小血肿面积,减轻脑组织含水量及血肿周围组织出血、水肿现象;TUNEL 染色显示,神经细胞凋亡阳性细胞数明显少于相同时间点的模型组;从三种用药剂量对各指标的作用效果来看,以中剂量作用更好一些,其与清开灵的药效作用相比,要么相似要么更佳。 2. 救脑宁注射液有不同程度地提高神经细胞代谢率及 DNA、RNA 含量,降低 LDH 漏出率与凋亡率,改善缺血再灌注致形态学异常变化 神经细胞造模后,细胞代谢率 MTT 明显下降,LDH 漏出率、凋亡率明显升高,与正常对照组比较 p<0.05;形态学表现为:(1)倒置相差显微镜:可见有的细胞体积变大,轮廓不清,光晕不明显,突起肿胀、断裂或短缩。而有的细胞则体积缩小,颜色加深,光晕消失;(2)普通光学显微镜:HE 染色,神经元的数目较正常对照组明显减少,神经元突起形成的网络明显稀疏。神经元发生不同程度的肿胀,轮廓不清,突起有断裂、短缩;部分神经元体积变小,深染,出现核固缩现象等;Nissl’s 染色,可见细胞内尼氏体明显减少,模糊不清。(3)荧光显微镜:细胞内染色质稀疏,DNA、RNA 含量均减少,荧光强度明显减弱;部分神经细胞核明显固缩,核内染色质凝集呈块状分布,核膜完整。上述损伤性变化以缺血 2h+再灌注 4h 时为重。 救脑宁注射液高、中、低剂量组,在各时间点表现出不同程度地提高细胞代谢率、降低 LDH 漏出率和凋亡率的作用,与模型组比较 p<0.05;同时也显示出改善细胞形态学异常变化、增加细胞内 DNA、RNA 含量,保护神经细胞功能与结构免遭?