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糖尿病性白内障(diabetic cataract，DC)是糖尿病病人中发生较早的眼部并发症，是致盲的主要原因之一。糖尿病患者的年龄相关性白内障具有发病年龄早、晶状体混浊进展快以及容易成熟的特点。手术是白内障有效的治疗方式，尽管当前手术设备和技术都有很大的发展和提高，但糖尿病患者的手术并发症的发生率较高。随着糖尿病发病率不断增加，DC引起越来越多的重视，但其发病机制尚不明确。 研究目的： 本研究运用DC晶状体上皮细胞的miRNAs表达谱和体外高糖模型，研究miR-30a对晶状体上皮细胞的EMT和自噬的调控机制，探讨其在DC发病过程中的作用。 研究方法： 1.利用miRNA芯片技术，建立正常晶状体和DC晶状体上皮细胞的miRNAs表达谱，筛选差异表达的miRNAs(miR-30a)，并进行实时荧光定量PCR验证。 2.根据生物信息学数据库miRNA预测网站，预测miR-30a的靶基因，筛选其中与EMT和自噬相关的基因，进行双荧光素酶报告基因检测，明确miR-30a与预测靶基因的关系。 3.运用免疫组织化学染色和Western blotting技术，检测上皮细胞标志物(E-cadherin)和EMT晚期标记物（vimentin和α-SMA）的表达;使用透射电镜技术观察自噬小体的形态。 4.建立体外高糖模型，包括晶状体囊袋体外培养高糖模型和晶状体上皮细胞(HLECs-B3)高糖模型，从而模拟晶状体上皮细胞在体内的高糖状态。 5.在体外高糖模型中，通过转染miR-30a模拟物和抑制物调节miR-30a的表达，进而达到调控EMT和自噬的目的。利用Western blotting和实时荧光定量PCR检测靶基因（SNAI1和BECN1）、EMT晚期标记物（vimentin和α-SMA）和自噬标记物（LC3BI和LC3BII）的蛋白和mRNA表达量;流式细胞仪检测晶状体上皮细胞的细胞凋亡率。 研究结果： 第一部分 miR-30a靶向结合SNAI1基因调控晶状体上皮-间质转化 1.1 糖尿病性白内障晶状体上皮细胞中EMT和miR-30a的表达变化 (1)通过免疫组织化学染色和Western blotting发现，与正常晶状体相比，DC晶状体上皮细胞的E-cadherin蛋白表达下降，而vimentin和α-SMA的蛋白表达则增高。 (2)miRNA芯片结果显示，与正常晶状体上皮细胞相比，DC晶状体上皮细胞中有73个miRNAs表达增高2倍以上，199个miRNAs表达下降超过两倍，其中miR-30a表达下降约180倍。实时荧光定量PCR结果也验证了miR-30a在DC晶状体上皮细胞中表达明显下降。 1.2 体外高糖模型的晶状体上皮细胞中EMT和miR-30a的表达变化 (1)免疫组织化学染色显示，高糖刺激可以晶状体上皮细胞中的vimentin和α-SMA表达增高。 (2)实时荧光定量PCR结果显示，体外高糖环境下，晶状体上皮细胞的miR-30a表达明显下降。由此可见，我们建立的晶状体囊袋体外培养高糖模型可以充分模拟DC晶状体上皮细胞在体内的状态。 1.3 SNAI1基因是miR-30a的靶基因 (1)通过生物信息学数据库miRNA预测网站（TargetScanHuman，http://www.targetscan.org/），预测miR-30a可以靶向结合于SNAI1的3UTR(706-713)。 (2)双荧光素酶报告基因检测显示，当pmiR-RB-REPORT-SNAI1-3UTR和miR-30a mimic（模拟物）共表达时，荧光素酶活性明显下降;将SNAI13UTR的结合位点突变，解除了miR-30a对SNAI1的负性调控作用，荧光素酶活性增强。因此，研究表明SNAI1是miR-30a的靶基因。 (3)晶状体囊袋体外培养高糖模型中，miR-30a可以直接调控SNAI1的表达。实时荧光定量PCR结果显示，miR-30amimic组中SNAI1的mRNA表达明显下降（mimic NC作为对照，P＜0.05）;miR-30a inhibitor（抑制物）组中SNAI1的mRNA表达明显增多（inhibitor NC作为对照，P＜0.05）。Western blotting结果显示，miR-30a mimic组中SNAI1的蛋白表达明显下降(mimic NC作为对照，P＜0.05);miR-30a inhibitor组中SNAI1的蛋白表达明显增多（inhibitor NC作为对照，P＜0.05）。 1.4 miR-30a通过SNAI1基因负性调控EMT (1)Western blotting结果显示，miR-30a mimic可抑制高糖诱导的EMT晚期标记物vimentin和α-SMA的蛋白表达（mimicNC作为对照，P＜0.05）。 (2)miR-30a mimic可抑制TGF-β2诱导的高EMT水平。Westem blotting检测发现，加入TGF-β2后vimentin和α-SMA的蛋白表达明显增高，说明高糖环境下TGF-β2可诱导晶状体上皮细胞发生EMT;同时加入TGF-β2和miR-30amimic后，vimentin和α-SMA蛋白表达下降，EMT受到抑制。 第二部分 miR-30a靶向结合BECN1基因调控晶状体上皮细胞的自噬 1.1 糖尿病性白内障组织中miR-30a表达下降 miRNA芯片结果显示，与正常晶状体上皮细胞相比，DC晶状体上皮细胞中miRNAs表达上调幅度最大的前5个miRNAs分别是miR-431-5p、miR-3169、miR-371a-3p、miR-1537和miR-593-3p，表达下调幅度最大的前5位分别是miR-30a-5p，miR-193a-3p，miR-204-5p，miR-184和miR-29b-3p。实时荧光定量PCR进行验证，结果与miRNA芯片一致，DC晶状体上皮细胞中miR-30a的表达明显下降。 1.2 糖尿病性白内障组织中自噬变化 透射电镜结果显示，人DC晶状体上皮细胞中自噬小体体积增大，且单个自噬小体中包含多个待降解的线粒体。 1.3 BECN1是miR-30a的靶基因 (1)生物信息数据库(TargetScanHuman，http://www.targetscan.org/)预测，miR-30a可直接与BECN1的3UTR（240-247）靶向结合。 (2)双荧光素酶报告基因检测，当pmiR-RB-REPORT-BECN13UTR和miR-30a agomir（模拟物）共表达时，荧光素酶活性明显下降;将BECN13UTR的结合位点突变，可以解除miR-30a对BECN1的负性调控作用，荧光素酶活性增强。因此，研究表明BECN1是miR-30a的靶基因。 (3)高糖培养环境下，miR-30a agomir可降低晶状体上皮细胞(HLECss-B3)中BECN1的蛋白表达量（agomirNC作为阴性对照，P＜0.05）;相反，miR-30aantagomir（抑制物）可导致BECN1蛋白表达增高（antagomir NC作为阴性对照，P＜0.05）。 1.4 miR-30a可抑制高糖诱导的晶状体上皮细胞的自噬 (1)高糖通过BECN1依赖途径诱导晶状体上皮细胞的自噬。LC3B是最重要的自噬标记物，LC3BII/LC3BI比值增大代表自噬小体形成增多，比值下降则代表自噬小体形成受损。高糖培养环境下晶状体上皮细胞中的LC3BII/LC3BI比值明显增大;加入BECN1siRNA后，LC3BII/LC3BI比值下降。 (2)miR-30a可抑制高糖诱导的自噬。转染miR-30a agomir后，LC3BII/LC3BI比值明显下降（agomir NC作为对照组，P＜0.05）;同时，LC3B的mRNA的表达也是下降（agomir NC作为对照组，P＜0.05）。 1.5miR-30a可抑制晶状体上皮细胞的凋亡。高糖培养环境下晶状体上皮细胞的凋亡增多，加入miR-30a agomir后发生凋亡的细胞减少（agomir NC作为对照组，P＜0.05）。 研究结论： 1.正常晶状体和糖尿病性白内障晶状体上皮细胞中的miRNAs表达存在差异，其中miR-30a表达下降约180倍。 2.晶状体囊袋体外培养高糖模型中，miR-30a通过靶向结合SNAI1基因，抑制晶状体上皮细胞EMT的发生。 3.高糖培养环境下，miR-30a通过靶向结合BECN1基因，抑制晶状体上皮细胞的自噬。 4.miR-30a可以抑制高糖诱导的晶状体上皮细胞的凋亡，对晶状体上皮细胞起保护作用。