论文部分内容阅读
目的1.初探锌指蛋白X偶联(Zinc-finger protein X-linked,ZFX)在结直肠癌(colorectal cancer,CRC)耐药中的生物学作用及其相关调控机制。2.探讨ZFX在结直肠癌组织里的表达是否可以作为II/III期结直肠癌患者术后化疗疗效的预测指标。材料与方法1.利用Real-time PCR检测不同结直肠癌细胞株中ZFX的表达情况。2.在人结直肠癌细胞株SW480和SW620中建立稳定沉默ZFX的细胞系;通过MTT实验,克隆形成试验,流式细胞术检测肿瘤细胞的生物学功能变化情况;通过Western-blot验证自噬标志物LC3-II/LC3-I的变化;通过MTT药敏实验计算出半数抑制浓度IC50(μM)。3.构建裸鼠皮下种植实体瘤模型,利用裸鼠成瘤实验在体内验证ZFX对结直肠癌细胞的增殖能力的影响。4.运用高通量基因芯片联合慢病毒干扰技术对结肠癌细胞进行RNAi筛查,随后根据GO分析,Pathway分析和生物信息学分析,探究结直肠癌细胞中ZFX所调控的下游分子及涉及的生物学过程。5.在稳定沉默ZFX的细胞系中,运用小干扰RNA技术下调DUSP5的表达,通过MTT实验验证ZFX-DUSP5轴对结直肠癌细胞增殖能力的影响。6.查阅Reactome数据库构建DUSP5与MAPK相关信号网络,Western-blot进一步验证MAPK信号通路相关蛋白的表达变化。7.选取290例II/III期术后接受一线化疗的患者原发手术标本中肠癌组织和匹配的癌旁组织,免疫组化检测组织切片中ZFX蛋白的表达,通过统计学方法分析其临床意义。结果1.RT-PCR提示在6株常见的不同特性的结直肠癌肿瘤细胞株中,肠癌细胞株SW620和SW480中ZFX的表达最高。2.沉默ZFX表达后,SW620和SW480的增殖,抗凋亡,自噬均被抑制,并且增加了对化疗药物5-FU的敏感性。3.体内试验也表明沉默ZFX可以抑制结肠癌细胞株SW480和SW620的裸鼠皮下成瘤能力。4.沉默ZFX后,下游有290个基因发生上调和196个基因发生下调。根据相关生物信息学分析,筛选出与MAPK信号相关的5个相关基因,进一步通过Western-blot验证和查阅Reactome and Oncomine数据库,提示DUSP5有可能为ZFX调控下游靶蛋白。5.MTT实验表明在稳定沉默ZFX的细胞系中,运用小干扰RNA技术下调DUSP5的表达,能够回复结直肠癌细胞的增值能力。6.Reactome数据库提示DUSP5有可能通过MAPK1,MAPK3,和MAPK11激活MAPK信号通路。而我们进一步的Western-blot显示在稳定沉默ZFX的结直肠癌细胞系中,敲减ZFX后能够明显抑制ERK磷酸化,而相关的MEK,MAPK11磷酸化和ERK,MEK,MAPK11的表达没有改变。7.ZFX在结直肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织,与患者性别(P=1.000),年龄(P=0.900),肿瘤位置(P=0.706),肿瘤大小(P=0.799)均无显著相关性,而与肿瘤分化(P=0.005)和TNM分期(P=0.003)呈显著相关。多因素分析表明只有ZFX蛋白表达水平和TNM分期是影响结直肠患者总体生存的独立预后因素。在II/III期术后接受FOLFOX化疗方案的患者中,ZFX蛋白高表达的患者往往预示着较低的总体生存率和无病生存率。结论本研究通过体外体内实验证实ZFX能够诱导自噬增强结直肠癌细胞对5-FU的耐药,揭示了ZFX通过抑制DUSP5的表达激活了ERK-MAPK信号通路的分子机制。大样本的临床回顾分析表明ZFX高表达的II/III期结直肠癌患者在接受FOLFOX化疗方案后总体生存率和无病生存率都明显低于ZFX低表达患者,可作为结直肠患者总体生存的独立预后因素。最终从体外-体内-临床层次解析ZFX在结直肠癌患者耐药中的临床意义和分子机理。本项目为II/III期结直肠患者术后监测提供新型动态预警标记物,也为其化疗抵抗提供新的可能靶点,最终改善Ⅱ/Ⅲ患者的总体预后。