背景:截止到2012年,英、美、中国以及阿拉伯地区国家的糖尿病(Diabetes mellitus,DM)的患病率已分别高达8%、11.5%、16%与18%1。中国糖尿病患病率逐年升高,全国已有超过9250万人患有糖尿病,此外尚有约1.51亿人正处于糖尿病前期2。目前糖尿病心血管并发症是糖尿病患者的“第一杀手”,74%-81%的糖尿病患者均死于突发的心血管意外事件。随着对动脉粥样硬化(AS)发病机制的深入研究以及血管再通治疗的更为广泛的开展,糖尿病导致的冠状动脉大血管病变的治疗已取得了阶段性进展,然而,糖尿病导致心肌微血管损伤的机制却仍不明确3。目前国内外对糖尿病心脏损害的治疗策略,主要包括控制血糖、调节能量代谢、及应用钙通道阻滞剂等4,5,但遗憾的是,糖尿病患者心血管意外事件的发生率以及死亡率仍居高不下,防治任务仍十分艰巨。影响心血管意外发生及其死亡率的一个重要因素就是心肌微循环水平,其直接影响心肌灌注并决定冠脉储备,对于维持心肌细胞正常的生理功能至关重要,2007年N Engl J Med的文章曾指出,糖尿病心肌微循环障碍与糖尿病患者心脏病的预后密切相关;并预测,糖尿病心肌微血管可能是糖尿病心脏病变重要的治疗靶点。然而,到目前为止,糖尿病心肌微血管损伤的机理仍不清楚。最新研究显示糖尿病心肌损伤与心肌组织局部慢性炎症密切相关,但心肌组织中的炎性因子却并非心肌细胞所分泌6。在国家自然科学基金(No.81070126,No.81300078)的资助下,我室对糖尿病心肌的损伤及机制进行了初步探讨,结果发现:糖尿病状态下,心肌微血管密度下降,屏障功能破坏,心肌微血管内皮细胞(CMEC)产生大量ROS与TNF-α、IL-1β、IL-2等炎症因子,诱发局部炎症反应(Inflamm Res.2011;PLo S ONE.2012;Basic Res Cardiol.2014),但介导血管新生的能力却下降(Microvasc Res.2010;Apoptosis.2010)。那么,糖尿病心肌微血管内皮细胞同时出现局部炎症反应增强和血管新生能力下降的现象,是否只是巧合?或是背后存在关联?目前尚不明确7,8。研究显示,α7亚型尼古丁乙酰胆碱能受体(α7n ACh R)是胆碱能抗炎通路上的关键效应分子(Nature,2003),干扰其生成或者敲除后,不管是电刺激还是应用α7n ACh R激动剂都无法抑制TNFα等炎症因子的释放。笔者所在实验室在国际上率先发现尼古丁乙酰胆碱能受体(n ACh Rs)可以通过调节干细胞生物学活性刺激心肌血管新生(Plos one,2009)。其他研究显示,在n ACh Rs家族中,介导血管新生的正是其中的α7亚型-即α7n ACh R(J Cell Biochem,2009)。同时,笔者所在实验室还发现,鉴于α7n ACh R在介导血管新生中的重要作用,其靶向分子成像有望用于疾病早期血管新生的早期无创诊断(国科金No.81000141)。既然α7n ACh R在抗炎通路与血管新生通路上都发挥如此重要的作用,那么它在糖尿病心脏组织损伤中的作用如何呢?2012年2月4日,我们以α7n ACh R、diabetes、heart为关键词在pubmed上进行文献检索时发现,检索结果为零,这一在抗炎和促血管新生中具有重要作用的乙酰胆碱能受体在糖尿病心脏组织损害领域内的研究尚属空白。基于此,本课题拟对α7n ACh R在高糖导致的心肌微血管内皮细胞损伤中的作用进行深入探讨,以期揭示糖尿病心肌微血管内皮细胞炎症反应加重、血管新生能力下降背后重要的共同原因。针对这一情况进行干预,将有希望达到同时降低糖尿病心肌缺血损伤后的炎症反应及促血管新生的治疗目的,一箭双雕,有望为糖尿病缺血性心脏病的防治提供新的双重保护的思路和靶点。目的:1.验证高糖刺激是否是心肌微血管内皮细胞α7n ACh R表达下调的上游原因,阐明心肌微血管内皮细胞凋亡、血管新生能力下降及大量分泌炎症因子与α7n ACh R表达下调有关;2.进一步明确α7n ACh R在CMECs高糖损伤中的相关下游分子机制。方法:1.实验一(基于目的1,所有实验均重复3次):1.1心肌微血管内皮细胞的原代培养与鉴定,根据实验分组行正常或高糖培养基(25mm/l)培养,同时根据分组给与α7n ACh R激动剂GTS-21 dihydrochloride(DMBX-A)(10μM)或α7n ACh受体抑制剂甲基牛扁碱(Methyllycaconitine)。1.2实验分组:正常培养组(Con),高糖培养组(HG),正常培养+DMBX-A组(DMBX-A),正常培养+s Methyllycaconitine组(Methyllycaconitine),高糖培养+DMBX-A组(HG+DMBX-A),高糖培养+Methyllycaconitine组(HG+Methyllycaconitine)。1.3采用Tunel/DAPI免疫荧光双标法检测CMECs凋亡,Transwell小室检测CMECs迁移能力,In vitro vascularpermeability assy kit检测CMECs的通透性。1.4流式细胞仪检测CMECs活性氧(ROS)的水平。1.5试剂盒分别检测CMECs中一氧化氮(NO),一氧化氮合酶(NOS),超氧化物歧化酶(SOD)的表达水平。1.6 Matrigel基质胶培养检测CMECs管样结构的生成来检测血管新生成管能力。2.实验二(基于目的2,所有实验均重复3次):2.1心肌微血管内皮细胞的原代培养与鉴定,方法与分组同实验1.1。2.2采用试剂盒(Subcellular Protein Fractionation kit for Cultured Cells)对细胞核与细胞膜分离。2.3 Western杂交方法检测CMECs中α7n ACh R/JAK2/AKT/NFk B的表达情况。2.4 RT-PCR检测CMECs中i NOS/e NOS的表达情况。结果:1.实验一:1.1本实验原代分离培养的心肌微血管内皮细胞低密度乙酰脂蛋白荧光染色阳性,证实CMECs模型建立成功。1.2与正常培养相比,高糖培养组中的CMECs凋亡指数明显增加,DMBX-A显著减少细胞凋亡,而对于Methyllycaconitine抑制组凋亡有明显增加。1.3与正常培养相比,高糖培养组中的CMECs的迁移能力减弱,DMBX-A显著恢复细胞迁移能力,而对于Methyllycaconitine抑制组迁移能力有明显降低。1.4与正常培养相比,高糖培养组中的单层CMECs的通透性增加,DMBX-A显著降低细胞通透性,而对于Methyllycaconitine抑制组细胞通透性有加剧显著。1.5流式细胞仪检测结果显示与正常培养相比,高糖培养CMECs活性氧簇的产生增多,DMBX-A可以明显抑制此现象,而Methyllycaconitine抑制组可使ROS增多加剧。1.6与正常培养组相比较,高糖培养组CMECs所产NOS活力上升、NO增加同时SOD减少,DMBX-A组可以减缓此趋势,而Methyllycaconitine培养组加剧了NOS活力和NO的产生并且明显的降低了SOD的水平。1.7采用Matrigel基质胶三维成型铺板培养后,与正常培养液组相比较,高糖培养组CMECs的成管能力降低,DMBX-A可以提高细胞成管能力,而Methyllycaconitine组中基本没有管样结构的形成。2.实验二:2.1 Western blot结果显示与正常组相比,高糖诱导的CMECs中JAK-2/p-AKT表达下调,NF-κB的表达升高,DMBX-A却缓解了上述的现象,而Methyllycaconitine组中此现象更为明显。2.2 RT-PCR结果显示与正常培养组比较,高糖培养的CMECs中i NOS/e NOS表达上调,DMBX-A组明显逆转此现象,Methyllycaconitine组可以明显加剧此现象。结论:1.α7n ACh受体的激活与高糖损伤的心肌微血管内皮细胞的病理生理变化密切相关;DMBX-A通过激活α7n ACh R,可以改善CMECs病理性改变:减少细胞凋亡,增加细胞成管能力与迁移能力,降低细胞通透性,减少ROS生成。2.α7n ACh R受体激活下游一系列信号转导通路:JAK2-p AKT-NFk B-i NOS/e NOS,调节i NOS/e NOS平衡,从而实现对高糖损伤的CMECs的保护作用。