低温脂肪酶产生菌的筛选及发酵工艺研究

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新疆地处我国大西北,存在着很多的低温环境(冰川和高山),为寻找低温微生物供了理想的采样区域。低温微生物所产的酶大多是低温酶。低温酶能在低温下有效发挥催化作用的特点,使其在生物工程领域有着广泛的应用前景。因此,对低温微生物的研究无论在理论上还是实践上都有重要意义。   本研究从来自新疆伊犁和阿勒泰地区的75份土样中分离出产低温脂肪酶的低温菌6株,经初筛和摇瓶复筛确定一株产低温脂肪酶活力较高的菌株N6-12作为进一步研究的出发菌株。菌株N6-12在完全培养基上20℃培养72 h后,菌落白色、圆形、隆起、不透明、表面光滑、湿润、边缘波状。菌体革兰氏阴性、杆状、能运动。常规生理生化测试表明,菌株N6-12兼性厌氧,最适生长温度25℃,40℃以上不生长,氧化酶反应阳性,接触酶反应阳性,不产H2S,明胶液化刚性,水解淀粉阴性,反硝化作用阳性,脂酶阳性,能利用葡萄糖、果糖。经过16SrDNA鉴定,与假单胞菌有97.6%的相似度。结合形态学、生理生化特征和16SrDNA序列分析结果,初步认定菌株N6-12属于假单胞菌属,暂命名为Pseudomonas sp.N6-12。   对菌株N6-12产的脂肪酶的酶学性质进行了初步研究,结果表明该低温脂肪酶的最适催化温度为30℃,30℃下处理120min,酶活性仍有70%。该酶催化的最适pH6.5,在不同pH下的稳定性试验显示,该酶在pH5.5~8内均较稳定。金属离子中,Cu2+、Fe3+对酶有较大的抑制作用,Na+则对酶有激活作用。在摇瓶发酵水平上,对假单胞菌N6-12的发酵产酶条件进行了研究,确定了其最佳培养基成分及最佳培养条件。研究了不同碳源、氮源、无机盐、产物、底物等因素对假单胞菌N6-12产酶的影响,发现玉米浆、豆粕粉、葡萄糖、装填量对产酶的影响较大。对玉米浆、豆粕粉、葡萄糖、装填量四因素各选取三个水平进行正交试验,确定假单胞菌N6-12产酶的最佳培养基成分为玉米浆2%,豆粕粉3%、葡萄糖1%,装填量为50ml/250ml。通过摇瓶发酵试验,确定其最佳培养条件为:25℃,180r/min,培养45h。在此条件下培养,低温脂肪酶酶活力达7.87U/mL,比优化前提高了76.8%。
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