猪等孢球虫生活史研究及其单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

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20头3日龄仔猪接种2×10~5个猪等孢球虫孢子化卵囊,在接种后6h~144h内分期剖杀,取十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、肺、气管、肠淋巴结、肝和胆囊等各部位组织块放入4%的中性福尔马林中固定,然后做石蜡切片用H.E染色,Olympus显微镜观察并拍照,并测定各阶段虫体大小,对猪等孢球虫的生活史进行观察。在内生性发育过程中,猪等孢球虫有3个无性繁殖和一个有性繁殖阶段。第一代无性繁殖阶段在感染后2~3天最突出,Ⅰ型裂殖体是纵长的,大小为7.5~12.5μm×4~6μm,平均10μm×4.7μm。Ⅰ型裂殖子和Ⅰ型裂殖体外形相似,大小为7.5~2.5μm×2.5~5.0μm。第二代无性繁殖阶段主要出现在感染后3~4天,产生2~4个裂殖子,单个或成群的Ⅱ型裂殖子位于同一寄生空泡,大小为5~10μm/2.5~5μm;感染后4~6天出现第三代无性繁殖阶段,裂殖体是球形或卵圆形的,包含2~12个核,Ⅲ型裂殖体的大小为7.5~10μm×3.5~7.5μm。Ⅲ裂殖体产生2~12个新月形的裂殖子。偶见这些裂殖子通过残体联在一起。Ⅲ型裂殖子的大小为4.75~8μm×1.25~1.5μm。成熟的有性繁殖阶段主要出现在感染后5~6天。这些阶段的虫体寄生于小肠的肠绒毛上皮细胞内和肠腺上皮细胞内。大肠和其他组织内没有发现内生发育阶段虫体。DPI120h,在收集的粪便中发现卵囊,潜隐期为5d,显露期为7d。28℃下卵囊最早孢子化时间为26h。在裂殖生殖后期、配子生殖和卵囊排出期间组织病变比较明显,主要包括肠粘膜上皮坏死和脱落、肠壁水肿、和炎性细胞浸润以及肠绒毛萎缩等,尤以回肠及其邻近部位最为严重。感染猪腹泻、食欲下降、消瘦乃至死亡。 将猪等孢球虫卵囊用饱和盐水漂浮法收集,然后用蔗糖密度梯度离心、滤器过滤、多次低速离心提纯后,通过冻融和超声波处理的方法制备抗原免疫Balb/c小鼠,以PEG4000为促融剂,取阳性的小鼠脾细胞与NSO骨髓瘤细胞融合。经间接ELISA方法筛选阳性孔,有限稀释法进行3次克隆,获得1株分泌抗猪等孢球虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株。上清效价为1:128,腹水效价为1:12800。采用免疫荧光法对单抗腹水进行初步鉴定,发现单抗是针对猪等孢球虫卵囊壁的。对单抗的腹水提纯后进行SDS-PAGE电泳分析,其重链分子量约为50KDa,轻链分子量为24KDa。
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