目的： 干扰素α(Interferon-α，IFN-α)是一类重要的细胞因子，具有广谱抗病毒、抗细胞分裂和免疫调节作用，临床上广泛应用于多种病毒性疾病和肿瘤的治疗。IFN作为蛋白质类药物，主要存在生物半衰期短和活性不稳定的问题，前者要求给病人频繁注射，后者致使药物在大剂量长期使用时产生较大副作用，因此开发长效和高效的IFN是目前的发展方向。 通过改变分子内蛋白酶水解位点可以影响IFN的性能。本研究在分析IFNα-2b分子结构的基础上，选择处于非受体结合位点、位于空间结构表面且非保守序列的糜蛋白酶和谷氨酸-C内蛋白酶水解位点作为突变点，分别将第58位谷氨酸、第89位酪氨酸和第159位谷氨酸通过定点突变技术采用组氨酸进行置换。经Percent Accepted Mutation Matrix分析认为这三个位点被组氨酸置换后在进化上不会造成太大的差异，且不会产生新的蛋白酶的酶切位点。通过此结构改建，期望获得活性增高、分子更加稳定的新型IFNα-2b突变体。本研究的目的之一是从分子水平改变IFN，构建两条突变体分子：突变体1：IFNα-2bHis58；突变体2：IFNα-2bHis89/His159。 通过克隆IFNα-2b两突变体基因，并保留未突变的IFNα-2b基因，以便于从生物学活性及体内稳定性上对三者进行比较，探讨能否通过这一方法达到保证和改善必需的生物活性的同时改善IFN在血液中的稳定性，这是本研究的目的之二。 方法与结果： 1、IFNα-2b及其两突变体基因的克隆与构建 本课题利用定点突变PCR的方法，将IFNα-2b分子上第58位Glu突变为His，得到IFNα-2b突变体1：IFNα-2bHis58；将IFNα-2b分子上第89位Tyr突变为His，第159位Glu突变为His，得到IFNα-2b突变体2：IFNα-2bHis89/His159。为了进行比较，同时扩增了未突变的IFNα-2b基因。将扩增的这三段基因和原核表达载体pET23b分别用NdeI和EcoR I双酶切，再用T4DNA连接酶将pET23b与三段基因分别连接，所得的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，进行筛选鉴定。 三个重组质粒经NdeI和EcoR I双酶切鉴定表明在500bp处有一特异性条带，这与两条分子的DNA序列的大小501bp相符；菌体PCR表明成功转化，为阳性克隆；重组质粒经DNA序列测定表明，其核苷酸序列和预期结果一致，证实三段基因均正确插入质粒中，成功构建重组表达质粒。 2、IFNα-2b及其两突变体蛋白的表达及纯化 含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)经小量培养后，采用摇瓶培养大量制备IFNα-2b及其突变体蛋白。摇瓶培养结束后离心收集并洗涤菌体，采用超声破菌的方式获得包涵体。包涵体经洗涤、增溶后，用7mol/L的盐酸胍变性，用硼酸盐缓冲液复性，复性液透析后，先后经阴离子交换层析和阳离子交换层析，得到较纯的IFNα-2b及其突变体蛋白。 用15％还原性SDS-PAGE电泳检测表达量，目的蛋白的表达量大于40％，主要以包涵体的形式存在，表达产物的分子量在20KDa左右，这与IFNα-2b的理论分子量相符。经15％非还原性SDS-PAGE电泳检测表明纯度在95％以上。 3、IFNα-2b及其突变体的质量检测 IFNα-2b突变体的分子量采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱法测量；IFNα-2b及其突变体的浓度采用Lowry法测定；采用细胞病变抑制法(CPE)测定IFNα-2b及其突变体的生物活性，计算其比活性。 结果：IFNα-2bHis58的分子量为19239.98，与其理论分子量完全相符；IFNα-2b比活性大于1.68×108IU/mg、IFNα-2bHis58比活性大于3.46×108IU/mg、IFNα-2bHis89/His159的比活性大于2.80×108IU/mg。由测活结果得知IFNα-2bHis58的活性较突变前提高一倍多，IFNα-2bHis89/His159的活性也较突变前有所提高。 4、IFNα-2b及其突变体的初步药代动力学试验 以SD大鼠进行初步药代动力学研究，三种IFN各为一组，每组六只大鼠，经皮下注射给药2.5×107IU/kg，按设计好的时间点经鼠尾静脉取血，用CPE法检测各血清样品中IFN的保留活性，绘制血药活性-时间曲线，采用DAS软件进行数据拟合，分析药代动力学参数。 结果：表明IFNα-2b的t1/2β为1.72h，IFNα-2bHis58的t1/2β为2.30h，IFNα-2bHis89/Hjs159的t1/2β为2.34h，半衰期较突变前略有延长。 结论： 1、本研究采用分子生物学、生物信息学和计算机辅助设计的办法设计了2条IFNα-2b突变体分子，成功构建了IFNα-2b突变体基因，并完成了工程菌构建。 2、确定了IFNα-2b突变体的培养条件，包涵体的表达量在40％以上。 3、摸索到了IFNα-2b突变体的分离纯化工艺，流程简单，得率较高，纯度达到95％以上。为IFNα-2b的生产探索到了简单的方法。 4、IFNα-2b突变体蛋白经CPE法测活，证实突变后生物活性大于未突变的IFNα-2b，获得了高性能的新分子。 5、IFNα-2b突变体的体内稳定性得到了改善，证实了通过IFNα-2b自身分子改造，置换蛋白酶的酶切位点这一方法来实现长效目的的可能性，为进一步摸索重要酶切位点提供了理论依据及实验依据。