黄姑鱼超氧化物歧化酶家族基因的克隆、表达及其功能研究

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超氧化物歧化酶(SOD,EC1.15.1.1)是一种关键的酶类抗氧化物质,筑起了生物体针对氧毒性的第一道防线,将氧自由基快速歧化为普通分子氧(O2)和过氧化氢(H2O2)。本研究从已构建的黄姑鱼(Nibea albiflora)转录组数据库中筛选出三种SOD基因:胞质型铜锌SOD(IcSOD,MG208871)、胞外型铜锌SOD(EcSOD,MF974567)和锰SOD(MnSOD,MG208872),并对它们的分子特征及功能进行了研究,结果如下:(1)在氨氮和亚硝态氮急性毒性实验中,黄姑鱼表现出对氨氮胁迫更为敏感,其氨氮和亚硝态氮的96小时半致死浓度(LC50)分别为20.23 mg/L(换算成非离子氨0.57 mg/L)和99.08 mg/L,安全浓度分别为2.02 mg/L(换算成非离子氨0.06 mg/L)和9.91 mg/L。(2)黄姑鱼IcSOD(NaIcSOD)cDNA全长793 bp,包括58 bp的5?非编码区(UTR)、270 bp的3?非编码区(UTR)和465 bp的开放阅读框(ORF),编码154个氨基酸。NaIcSOD不具有信号肽和跨膜区。NaIcSOD mRNA在所检测的11个组织或器官(心脏、肝、脾脏、头肾、中肾、鳃、肠、胃、脑、肌肉和鳔)中均有表达,在头肾中表达量最高,其次为脑、肝脏、心脏和鳃,在肌肉中表达量最低。黄姑鱼经氨氮/亚硝态氮急性攻毒后,其肝脏、鳃和头肾组织的NaIcSOD mRNA均不同程度上调。此外,通过原核表达获得了具有生物活性的NaIcSOD,研究表明该酶具有良好的温度和pH稳定性。(3)黄姑鱼EcSOD(NaEcSOD)cDNA全长1101 bp,包括224 bp的5?UTR、229 bp的3?UTR和648 bp的ORF,编码215个氨基酸。氨基酸序列分析表明,NaIcSOD不具有跨膜区,含有1条信号肽序列(0-26 aa)。NaEcSOD mRNA在所检测的11个组织或器官中均有表达,肝脏中表达量最高,其次为脑、鳔和胃,在肌肉中最低。黄姑鱼经氨氮/亚硝态氮急性攻毒后,其肝脏、鳃和头肾组织的NaEcSOD mRNA均有不同程度上调。通过原核表达,获得了具有生物活性的NaEcSOD,测得该酶具有良好的温度和pH稳定性。此外,GST pull-down实验表明NaEcSOD蛋白与膜联蛋白A4(annexin A4)存在相互作用。(4)黄姑鱼MnSOD(NaMnSOD)cDNA全长949 bp,包括38 bp的5’UTR、233 bp的3?UTR和678 bp的ORF,编码225个氨基酸。NaMnSOD无跨膜区,含有1条信号肽序列(0-27 aa)。NaMnSOD mRNA在所检测的11个组织或器官中均有表达,心脏中表达量最高,其次为脑、肝脏和鳃,在脾脏中最低。黄姑鱼经氨氮/亚硝态氮急性攻毒后,其肝脏、鳃和头肾组织的NaMnSOD mRNA均不同程度上调。上述研究结果表明,黄姑鱼对氨氮和亚硝态氮的耐受力差,在黄姑鱼的集约化养殖过程中,对养殖水体中氨氮和亚硝态氮的实时监控尤为重要。IcSOD、EcSOD和MnSOD在黄姑鱼抵抗氨氮/亚硝态氮污染中均发挥重要作用,可以作为水体污染监测的早期生物标志物。NaIcSOD和NaEcSOD蛋白均表现出良好的酶活力以及温度/pH稳定性,具有较大的应用前景。
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